小兒原發(fā)性免疫缺陷病 的檢查：

淋巴細(xì)胞計數(shù) 干擾素

免疫缺陷病的臨床特點及癥狀雖然提供了診斷線索，但最后都依賴于免疫水平的檢測以及對試驗結(jié)果的正確評價來確診。對臨床表現(xiàn)提示免疫缺陷的患兒應(yīng)先做過篩檢查，若無異常發(fā)現(xiàn)而臨床上仍然提示免疫低下的小兒應(yīng)做進(jìn)一步的免疫檢測試驗。
1.體液免疫功能檢查 體液免疫反應(yīng)篩選檢查常用單向免疫擴散法, 測定血清IgG、IgA和IgM。
(1)應(yīng)注意以下兩點：
①正常值的差異：血清免疫球蛋白的正常值隨年齡和地區(qū)有差異，應(yīng)使用本地區(qū)的，最好是本單位各年齡組正常值。一般血清IgG<2g/L、IgA<50mg/L、IgM<100mg/L可視為缺乏。
②測定血清白蛋白：以除外由于蛋白質(zhì)缺乏或丟失過多所致低免疫球蛋白血癥。
(2)血漿蛋白定量和蛋白電泳：是篩查體液免疫缺陷的必要手段。根據(jù)丙種球蛋白的絕對和相對值，可判斷Ig合成是否減少。如果丙種球蛋白定量少于6g/L，醋酸纖維薄膜蛋白電泳丙種球蛋白低于0.125(12.5%)，則應(yīng)進(jìn)一步做Ig定量檢查。
(3)血清Ig及亞類定量：
①血清Ig含量測定：是檢測B細(xì)胞功能最常用的試驗。其中IgG、IgM及IgA多采用單向瓊脂免疫擴散法測定，而IgD和IgE因含量極少則采用放免法(RLA)或酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定。當(dāng)Ig總量<4g/L或IgG含量<2g/L時，則極易感染。血清Ig濃度隨年齡增長而升高，需設(shè)定當(dāng)?shù)馗髂挲g組正常值，若IgG含量低于正常值2SD以下應(yīng)視為異常;患兒有反復(fù)細(xì)菌感染而Ig濃度正常時，不能排除抗體缺陷癥或IgG亞類缺陷，應(yīng)作進(jìn)一步檢查;正常人血清中IgE含量極低且正常值范圍極寬，故只有測定某個過敏原的特異性IgE才較有意義。
②IgG亞類的測定：血清IgG正?；蚱停指叨纫捎畜w液免疫缺陷者，可測定血清IgG亞類?？刹捎肊LISA或單向免疫擴散法，對各亞類單克隆抗體進(jìn)行測定。低于本地區(qū)同齡兒童正常值2SD者疑為低下。
(4)抗體檢測：血清IgG及其亞類值正常，而又高度疑有抗體缺陷者，應(yīng)測定特異性抗體及抗體反應(yīng)。臨床上常檢測：
①天然抗體：包括血型抗體(抗A及抗B)的同族凝集素、噬異凝集素、抗鏈球菌溶血素“O”(ASO)以及對大腸埃希桿菌的抗體等,均可用來檢查IgM功能。對于免疫功能正常的非AB血型個體，生后6個月以上抗Al型和B型抗體滴度至少分別為1∶8和1∶4，1歲以上抗A和抗B的抗體滴度至少分別為1∶16和1∶8。若滴度低于正常則提示抗體缺陷。
A.噬異凝集試驗<1∶10或6個月嬰兒同族血凝素抗A<1∶8，抗B<1∶4，提示IgM抗體缺乏。
B.12歲以下兒童抗溶血性鏈球菌溶血素O(抗O)<1∶50者疑為IgG抗體反應(yīng)差。
②疫苗接種后抗體：接種麻疹疫苗、傷寒疫苗和百白破三聯(lián)疫苗后可分別檢測相應(yīng)的特異性抗體，如滴度較低則表明缺乏抗體反應(yīng)。
A.白百破疫苗(蛋白抗原)：未接受免疫者完成接種2周后或已接受免疫者加強注射1次后2周測定特異性抗白百破抗體效價(應(yīng)有正常對照)，或作錫克試驗(皮試紅斑>10mm為抗體不足)。
B.其他蛋白抗原：接種乙肝疫苗后測定抗乙肝病毒抗體。有條件者可用噬菌體Φχ174免疫后檢測抗原清除和抗體反應(yīng)(應(yīng)有正常對照)。以上兩種疫苗主要激發(fā)IgG1和IgG3抗體反應(yīng)。
C.多糖抗原：常用純化的多糖抗原有肺炎球菌和腦膜炎球菌多糖，接種2周后測血清特異性抗體，主要為IgG2成分。2歲以下嬰幼兒因IgG2產(chǎn)生能力差，檢測意義不大，此時應(yīng)接種與蛋白載體結(jié)合的多糖抗原，以利于激發(fā)IgG2抗體的產(chǎn)生。
疑及原發(fā)性免疫缺陷病者，應(yīng)禁用活疫苗(如卡介苗、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹和風(fēng)疹)。
③錫克試驗：一般在預(yù)防接種或加強注射2周后進(jìn)行，注射局部出現(xiàn)紅腫者為陽性反應(yīng)，表明IgG類抗體功能不良。應(yīng)注意少數(shù)患兒該實驗結(jié)果可為陰性，特別是在重復(fù)試驗之后。
④必要時可注入新抗原(流感嗜血桿菌的多糖抗原等)，以觀察相應(yīng)抗體的水平。
(5)B細(xì)胞檢測：用單克隆抗B細(xì)胞表面抗原CDL9和CD20抗體，以免疫熒光標(biāo)記法計數(shù)B細(xì)胞，觀察B細(xì)胞是否減少。主要借助B細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測，測定B細(xì)胞的方法很多，目前主要采用免疫熒光法。
①B細(xì)胞表面抗原及亞類測定：常應(yīng)用抗人單克隆抗體，經(jīng)熒光免疫方法測定B細(xì)胞特有的表面抗原(主要為CDL9和CD20);或檢測B細(xì)胞膜表面免疫球蛋白(SIg)，包括SIgG、SIgA、SIgM及SIgD，以區(qū)分B細(xì)胞亞類。B細(xì)胞數(shù)量一般占外周血單個核細(xì)胞的20%～30%。判定結(jié)果時應(yīng)注意與本實驗室相應(yīng)年齡組的正常值相比較。
②B細(xì)胞功能檢測：外周血單個核細(xì)胞經(jīng)美洲商陸(PWM)刺激后，轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生Ig的漿細(xì)胞。測定其上清液中的Ig濃度，以評價B細(xì)胞功能。
2.細(xì)胞免疫功能檢測
(1)淋巴細(xì)胞計數(shù)、形態(tài)及外周血象：
①淋巴細(xì)胞計數(shù)：是既簡便又直接的免疫缺陷檢查。外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)低于1.2×109/L應(yīng)考慮為T細(xì)胞缺陷，應(yīng)多次復(fù)查以確定是否持續(xù)減低。
②小淋巴細(xì)胞減少：很多細(xì)胞免疫缺陷病常出現(xiàn)小淋巴細(xì)胞減少，大淋巴細(xì)胞的胞漿淡染，形似單核細(xì)胞。
③貧血、中性粒細(xì)胞及血小板減少：有些免疫缺陷病患兒易伴發(fā)不同程度的貧血、中性粒細(xì)胞及血小板減少，這可能與自身抗體有關(guān)。
④嗜酸性粒細(xì)胞增高：T細(xì)胞缺陷者可合并嗜酸性粒細(xì)胞增高或單核細(xì)胞增多癥，偶見血小板增多癥。
(2)T細(xì)胞功能體內(nèi)檢測：即皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DHT)，皮內(nèi)注射0.1ml抗原或絲裂原引起局部皮膚免疫應(yīng)答，可作為T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的篩選。
①延遲性皮膚超敏反應(yīng)(DCH)：皮內(nèi)注射抗原0.1ml，于48～72h觀察注射部位的反應(yīng)，若紅、腫、硬結(jié)直徑10～15mm為陽性反應(yīng)，大于15mm為強陽性反應(yīng)。需同時觀察5種抗原，均為陰性時才表明T細(xì)胞功能缺陷。常用的皮試抗原天然抗原的有結(jié)核菌素(PPD)、鏈激酶-鏈導(dǎo)酶(SK-SD)、白色念珠菌素等3種，其中PPD、SD-SK較適用于兒科。
②結(jié)核菌素1∶100～1∶1000舊結(jié)核菌素，或10U結(jié)核菌素蛋白純衍化物(PPD)，72h觀察結(jié)果，陰性反應(yīng)者再用50U重復(fù)試驗。
③念珠菌液1∶10～1∶100，觀察48h。
④毛癬菌液1∶30，觀察48h。
⑤腮腺炎：原液注射，6～8h觀察抗體反應(yīng)(Arthu反應(yīng))，48h觀察DCH反應(yīng)。
⑥破傷風(fēng)、白喉毒素1∶100，觀察48h。
⑦其他：無上述條件者，亦可選用植物血凝素(PAH)66.6mg、鏈激酶-鏈導(dǎo)酶1～5U，觀察24h。紅暈>7mm者為陽性。PHA皮試不需事先致敏，宜用于兒科，但目前對PHA試驗的意義尚有爭議。若皮試結(jié)果為陰性，提示可能存在細(xì)胞免疫功能低下，判斷結(jié)果時應(yīng)注意：
A.一種抗原皮試的診斷意義較小，宜用至少2～3種抗原同時檢查，綜合考慮所得結(jié)果將更有意義。
B.需結(jié)合預(yù)防接種史和既往病史來分析陰性皮試的臨床意義。
C.新生兒皮試結(jié)果與細(xì)胞免疫功能不完全相符，可作X線檢查，有胸腺影者可排除嚴(yán)重的細(xì)胞免疫缺陷。
(3)體外T淋巴細(xì)胞的檢測：周圍血T淋巴細(xì)胞計數(shù)：采用單克隆抗體免疫熒光法或酶標(biāo)法檢測總T細(xì)胞(CD3 )、(CD4 )和CD8 細(xì)胞。CD4 T細(xì)胞識別主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ類抗原，又可分為Ⅰ類或Ⅱ類輔助性T細(xì)胞(Th1 CD3 或Th2);CD8 T細(xì)胞識別MHCI類抗原，主要參與細(xì)胞介導(dǎo)免疫(細(xì)胞毒性T細(xì)胞)。CD4 /CD8 T細(xì)胞數(shù)量異常可導(dǎo)致免疫缺陷或自身免疫疾病。測定CDL6表面標(biāo)記以計數(shù)自然殺傷細(xì)胞(NK)。疑及高IgM綜合征者，用佛波脂酸(PMA)和ionomycin活化T細(xì)胞后，檢測CD40配體表達(dá)。
①T細(xì)胞及其亞群計數(shù)：使用CD系統(tǒng)單克隆抗體,以免疫熒光抗體技術(shù)或流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞表面抗原，可反映T細(xì)胞數(shù)量和T亞群間的比例。
A.T淋巴細(xì)胞計數(shù)：成熟的T細(xì)胞表面具有CD2和CD3，采用抗CD2或CD3單抗可計數(shù)T細(xì)胞。
B.T細(xì)胞亞群計數(shù)：用抗CD4和CD8的單抗可計數(shù)兩大T細(xì)胞亞群并計算比例。正常人外周血中T細(xì)胞約占單個核細(xì)胞的70%，CD4/CD8比值為1.7±0.4。
②體外T細(xì)胞功能檢測：可用多克隆絲裂原PHA、美洲商陸(PWM)和刀豆素A(conA)、其他抗原(PPD)、真菌、鏈激酶、破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素)、超抗原(如中毒休克綜合征毒素)、同種異體細(xì)胞(混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng))和涉及信號傳遞系統(tǒng)的抗T細(xì)胞表面單克隆抗體(CD3、CD2、CD28和CD43抗體)刺激T細(xì)胞，觀察以下功能：A.活化功能：用單克隆抗體免疫熒光測定IL-2Rα(CD25)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受者(CD71)和MHCⅡ類分子表達(dá)。B.增殖功能：形態(tài)學(xué)觀察淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化或3H摻入觀察增殖指數(shù)。C.分化功能：培養(yǎng)上清液中IL-2、IL-4、IL-6及IFN-γ等細(xì)胞因子的活性測定。以上試驗均應(yīng)設(shè)對照組。檢測T細(xì)胞對體外刺激因子的反應(yīng)性，即分裂、增殖及轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞的能力。刺激因子包括(PHA、ConA)等絲裂原、(PPD、白色念珠球菌素等)抗原、針對T細(xì)胞表面分子的抗體和同種異體細(xì)胞等，其中念珠菌皮膚試驗是最有價值的一種。常用的方法有：
A.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗：測定T淋巴細(xì)胞母細(xì)胞化和(或)轉(zhuǎn)化率，或用<3H胸腺嘧啶摻入法測定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA合成能力，結(jié)果以每分脈沖數(shù)(CPM)或刺激指數(shù)(SI)表示。當(dāng)SI<3時,提示T細(xì)胞免疫缺陷;
B.介質(zhì)釋放的檢測：測定上述轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL)及其他淋巴因子，借助測定IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子水平來反映T細(xì)胞功能。
C.活化抗原的表達(dá)(如細(xì)胞表面IL-2受體的測定);
D.協(xié)同細(xì)胞培養(yǎng)：用協(xié)同培養(yǎng)方法測定T輔助細(xì)胞與T抑制細(xì)胞的功能。
3.吞噬功能檢測
(1)外周血白細(xì)胞計數(shù)和形態(tài)：白細(xì)胞計數(shù)持續(xù)低于4×109/L為異常。而Chédiak-Higashi綜合征等在顯微鏡下可觀察到粒細(xì)胞內(nèi)的某些異常(如巨大溶酶體顆粒)。
(2)中性粒細(xì)胞功能檢查：吞噬細(xì)胞功能測定包括周圍血中性粒細(xì)胞計數(shù)和形態(tài)觀察，以單克隆抗CDL4抗體標(biāo)記計數(shù)巨噬細(xì)胞，用硝基四唑氮藍(lán)(NBT)還原法檢測吞噬和殺菌力，以化學(xué)發(fā)光試驗了解其超氧根釋放能力。CDL1a、b、c單克隆抗體染色可證實有無黏附分子缺乏。包括隨意運動和趨化運動的檢測、吞噬和殺菌試驗、NBT還原試驗和化學(xué)發(fā)光試驗等。原發(fā)性吞噬功能缺陷病(表8)。
①運動能力檢測：如果白細(xì)胞運動能力差，當(dāng)發(fā)生感染時，無膿液形成，表明白細(xì)胞運動能力和趨化因子異常。
A.隨意運動檢測：可以通過觀察白細(xì)胞從毛細(xì)血管中游出、或通過微孔濾膜以及在瓊脂中擴散等方法加以判斷。懶白細(xì)胞綜合征、Chédiak-Higashi綜合征等白細(xì)胞隨意運動減弱。
B.趨化運動檢測：常用方法有Rebuck皮窗試驗、Boyden趨化試驗、瓊脂糖趨化試驗及腎上腺素刺激試驗等。
②吞噬和殺傷試驗：一般采用Quie定量殺菌試驗，可分別測定血清調(diào)理作用、胞吞作用和殺菌作用活性。正常人白細(xì)胞在120min內(nèi)細(xì)菌清除率可達(dá)95%，而慢性肉芽腫病患者的白細(xì)胞在同樣時間內(nèi)殺滅的細(xì)菌不足10%。
③NBT還原試驗：是一種簡便而敏感的定性方法，NBT還原試驗的正常值在10%以下，而慢性肉芽腫患者常<1%。
④化學(xué)發(fā)光試驗：該法與NBT試驗的結(jié)果相平行，但更加敏感，可用于評價吞噬細(xì)胞的代謝(氧化殺菌功能、調(diào)理活性和體液-吞噬細(xì)胞系統(tǒng))的綜合水平。
(3)脾掃描：在懷疑脾缺如時，如敗血癥反復(fù)發(fā)作，出現(xiàn)異形紅細(xì)胞，或末梢血涂片上有Howell-Jolly小體，應(yīng)作脾掃描。靜脈注射放射膠體金后，右上腹探測如缺乏放射活性則可確診為無脾癥。
4.補體和調(diào)理素檢測 對于體液和細(xì)胞免疫功能均正常，而又有反復(fù)感染的病人，應(yīng)懷疑補體系統(tǒng)缺陷。
(1)補體成分的測定：補體測定包括血清總補體溶血活性(CH50 )、單個補體成分(如C1q，r，s，C2～C9)和補體調(diào)節(jié)因子(如D因子、H因子、I因子、備解素和C1抑制因子)測定。
主要測定C3，能較敏感地反映體內(nèi)補體激活情況，可作為有些疾病的活動性指標(biāo)之一(但必須排除肝細(xì)胞病損等C3生成障礙疾患)。必要時可測定C1q、C2、C4、C5和C7等。C3 、C4含量常使用單向瓊脂擴散法檢測，C3b、C4b及C5～7對細(xì)菌的調(diào)理作用則可用化學(xué)發(fā)光試驗間接測定。
(2)調(diào)理素測定：當(dāng)病原微生物入侵時，如發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞功能正常，而其吞噬作用卻未增強，應(yīng)懷疑調(diào)理素缺陷。常見于鐮狀細(xì)胞貧血、C3缺乏癥、C5功能異常、新生兒和早產(chǎn)兒等。
5.其他檢查
(1)血液學(xué)檢查：包括末梢血象、血沉(ESR)、紅細(xì)胞及血小板方面的某些特殊檢查，是很有價值的篩選試驗。ESR正常則可排除慢性細(xì)菌感染;而紅細(xì)胞Howell-Jolly小體的檢查有助于確定先天性無脾癥;而Wiskott-Aldrich綜合征常有血小板形態(tài)的異常。淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)<1×109/L，除外繼發(fā)性因素后，提示嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)或胸腺發(fā)育不全。淋巴細(xì)胞計數(shù)正常不能排除SCID。男性患兒血小板數(shù)量減少、體積變小，提示W(wǎng)iskott-Aldrick綜合征。
(2)活體組織檢查：此檢查對于免疫缺陷病的診斷很有意義。包括：
①淋巴結(jié)活檢：注射白百破三聯(lián)菌苗于下肢皮下，應(yīng)在局部抗原注射后5～7天進(jìn)行同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)活檢。若淋巴結(jié)漿細(xì)胞缺如、皮質(zhì)變薄、生發(fā)中心缺失及淋巴濾泡很少，提示抗體為主的免疫缺陷;如發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)皮質(zhì)下深層淋巴細(xì)胞缺少提示細(xì)胞免疫缺陷，而皮質(zhì)淺層及生發(fā)中心淋巴細(xì)胞缺少時有體液免疫缺陷可能。同時有皮質(zhì)副區(qū)的淋巴細(xì)胞缺如則提示SCID。因傷口局部易繼發(fā)嚴(yán)重感染，此法不作為常規(guī)檢查。
②直腸和小腸黏膜活檢檢查：免疫組化檢查直腸組織漿細(xì)胞淋巴樣細(xì)胞，有助于常見變異型免疫缺陷病和選擇性IgA缺陷病的診斷。常用組織學(xué)及免疫組織學(xué)方法，直腸黏膜的漿細(xì)胞及類淋巴細(xì)胞明顯減少甚至缺如常提示為CVID或SIgAD。
③骨髓檢查：可除外其他血液系統(tǒng)疾病，了解漿細(xì)胞和前B細(xì)胞數(shù)量。重癥聯(lián)合免疫缺陷病或網(wǎng)狀組織發(fā)育不全患者，骨髓中的淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞均顯著減少。Bruton綜合征骨髓中很難找到漿細(xì)胞(但5歲以下的嬰幼兒也極少見到漿細(xì)胞)。
(3)特殊檢查：疑為SCID或T細(xì)胞免疫缺陷的患兒有條件時應(yīng)進(jìn)行血標(biāo)本中腺苷脫氨酶(ADA)及嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)的定量分析;對于酶正常的SCID或其他嚴(yán)重的T細(xì)胞免疫缺陷，如MHCⅠ型和(或)Ⅱ型抗原缺陷及Wiskott-Aldrich綜合征，可進(jìn)行適當(dāng)?shù)募?xì)胞表型(MHCⅠ型、Ⅱ型抗原)和(或)功能的測定。
95%的共濟失調(diào)毛細(xì)血管擴張癥的甲胎蛋白增加(40～2000mg/L)，有助于區(qū)別其他神經(jīng)系統(tǒng)疾患。測定中性粒細(xì)胞髓過氧化酶，紅細(xì)胞或中性粒細(xì)胞紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性可明確有無這些酶活性下降。染色體檢查對診斷共濟失調(diào)毛細(xì)胞血管擴張癥和胸腺發(fā)育不良有幫助。
6.基因診斷 經(jīng)過初篩診斷為原發(fā)性免疫缺陷病者，在條件具備的情況下，應(yīng)對已明確基因突變或缺失的疾病進(jìn)行基因?qū)W診斷，有助于產(chǎn)前診斷和遺傳學(xué)咨詢。
常規(guī)做X線、胸片、B超、心電圖等檢查。
X線檢查：結(jié)合正側(cè)位胸部透視或平片，注意胸腺影的存在及大小。6個月內(nèi)幼嬰缺乏胸腺影，提示胸腺發(fā)育不良。鼻咽部腺樣體組織很小或無陰影也為診斷細(xì)胞免疫缺陷的直接線索，均宜結(jié)合臨床淋巴結(jié)觸診及細(xì)胞免疫檢測確診。