真菌過敏性哮喘

(一)發(fā)病原因
1.真菌分類及其特征 真菌的種類很多，分布廣泛，自然界中約有10萬余種。受到地理、氣候等因素的影響，大氣中真菌的種類和含量變化很大，受到生活條件和生活習俗的影響，室內真菌的濃度也有很大的差異。致敏性強且空氣中飄散數(shù)量大的真菌種類有數(shù)百種，引起人體致敏的主要是室內真菌。盡管空氣中真菌的數(shù)量極大，形態(tài)各異，但它們都具有共同的特征。是具有絲狀體的分枝狀的營養(yǎng)結構，有細胞核和細胞壁，不含葉綠素，是典型地進行有性繁殖和無性繁殖的有機體，含有多糖和蛋白質等物質。根據(jù)現(xiàn)代分類學方法，真菌門下分為5個綱，與變態(tài)反應有關的共有4個綱。
(1)接合菌綱：本綱是較低等的一類真菌，也是數(shù)量最少的一個綱。其中毛霉科是該綱中最大的一個科，這個科中的毛霉、根霉、梨頭霉、共頭霉等，既是條件致病菌，也是引起變態(tài)反應的重要致敏真菌。
①菌絲多為管狀，通常無橫隔，有分枝，菌絲直徑較大。
②無性繁殖時，在孢子囊中產生孢子。
孢子囊通常生在營養(yǎng)菌絲的頂端或是生在被稱為孢囊梗的特殊繁殖菌絲的頂端。在孢子囊的幼期，其中充滿著多核的原生質。當發(fā)育時，整個原生質割裂成許多小塊，每個小塊發(fā)育成為一個孢囊孢子。孢囊孢子主要靠風力傳播，在適當?shù)臈l件下，孢子萌發(fā)一芽管，進而發(fā)育成新的菌絲體。
③有性繁殖時，為配子或配子囊交配，然后形成休眠孢子、接合孢子。
(2)子囊菌綱：是真菌中比較大的一個綱。從它們的復雜結構看，較接合菌進化得多，而且很可能是從接合菌演變而來。如空氣中常見的毛殼菌、蛹孢假殼菌、莢孢腔菌等。
①大多數(shù)種產生的子實體都含有子囊。子囊多為細長的棍棒形或圓筒形的袋狀結構，少數(shù)為球形、卵形或長方形。通常子囊為一個腔，里面形成子囊孢子，也有的為分隔子囊。
②子囊內具有一定數(shù)量的孢子，通常為8個，但因菌種的不同，孢子的數(shù)目多少不完全一樣。孢子的大小、形狀、顏色及其他特征變化很大。一般以子囊孢子的特征作為子囊菌分屬的依據(jù)。
③無性繁殖可通過分裂、芽殖、斷裂、粉孢子、厚垣孢子或分生孢子等進行。
④有性繁殖是將兩性的核結合起來，聚在一個細胞內，形成配偶，稱雙核期。經過連續(xù)的雙核并裂產生許多雙核細胞。雙倍體的核在將要發(fā)育成子囊的子囊母細胞中結合后，立即進行減數(shù)分裂，產生8個核，從而形成典型的8個子囊孢子。
⑤許多子囊菌，每年只出現(xiàn)1次有性階段，經常遇到的是分生孢子階段。
(3)擔子菌綱：這是真菌各綱中最高級的一個綱。如蘑菇、木耳、靈芝以及空氣中極常見的黑粉菌、銹菌等都屬于本綱。
①有特殊的產孢體，稱擔子，擔子上有4個擔孢子。擔孢子的質配、核配和減數(shù)分裂發(fā)生在擔子內。擔孢子可以是圓形、橢圓形、狹長形或臘腸形。無色素或有色素，顏色淺淡，當孢子成團堆積時方可識別。
②無明顯的生殖器官，兩性的結合是由未經分化的菌絲的結合或孢子的結合。結合時只行質配，不行核配，結果有一個雙核細胞期，并以特殊的鎖狀聯(lián)合的方式形成新的雙核細胞。兩性細胞核在形成孢子之前才行核配，隨之行減數(shù)分裂，產生單倍體的擔孢子。
③無性繁殖借助于芽殖、菌絲體的裂殖或產生分生孢子和粉孢子。黑粉菌經常產生分生孢子，它的分生孢子是從擔孢子和菌絲體兩者芽殖而形成的。銹菌產生夏孢子，它在起源上和功能上是分生孢子。許多其他的擔子菌也產生分生孢子。有些擔子菌的菌絲體通常裂成單細胞段，這些菌絲體的碎片即粉孢子。
④有性繁殖是以體細胞配合或受精作用來實現(xiàn)的。在產生細胞的種內，2個單核細胞菌絲互相接觸，接觸點的胞壁溶化，一個細胞的核穿孔而進入另一個細胞內，使之成為雙核。這個雙核細胞連續(xù)分裂產生二生的雙核菌絲體。在產生粉孢子的擔子菌的種內，質配作用常在粉孢子和營養(yǎng)菌絲的聯(lián)合時發(fā)生?？傊?，擔子、雙核菌絲體和鎖狀聯(lián)合的形成，是擔子菌的3個典型特征。
(4)半知菌綱：這一綱是尚未發(fā)現(xiàn)有性階段的子囊菌及少數(shù)擔子菌的分生孢子階段的類群。它還包括一些在有性階段發(fā)現(xiàn)前已經描述及定名的已知子囊菌及擔子菌的無性階段。如曲霉、青霉、芽枝菌、交鏈孢霉、木霉等。
①它們僅靠分生孢子或菌絲的碎片進行繁殖。分生孢子通常產生在分生孢子梗上，分生孢子梗的形態(tài)不一，它們的產生可以從普通的營養(yǎng)菌絲而來，無任何明顯的器官，或者可以組成一定的子實體，最普通的子實體有分生孢子器及分生孢子盤。
②在它們的生活史中，僅發(fā)現(xiàn)了無性階段，所以稱之為半知菌。
③菌絲都有分隔。很多為腐生菌，但有許多對人類極為重要，是引起植物、動物和人類病害的寄生菌。
2.空氣中氣傳真菌調查 空氣中真菌的調查是探明各地空氣中常見真菌種類、數(shù)量、季節(jié)分布情況的一種重要方法，這對于篩選致敏真菌，指導真菌變態(tài)反應患者的診斷和治療有重要意義。制備真菌變應原的菌種的選擇，就是根據(jù)空氣中的調查資料配合真菌的致敏性來確定的。把空氣中最常見、孢子播散數(shù)量最大和致敏性最強的真菌進行分離和篩選，保留純菌種，進行實驗室培養(yǎng)，可制備成各種真菌變應原浸液供臨床診斷和免疫治療。
一般認為，真菌調查由曝片和曝皿同步進行，由于曝片調查對某些較小的真菌孢子難以觀察和分辨，所以曝皿調查也是非常重要的。通常調查應至少持續(xù)1年才能較為全面地了解該地區(qū)主要致敏真菌。
(1)空氣中曝片及鏡檢計數(shù)方法：
①曝片方法：于空氣中暴露涂有軟凡士林黏附劑的載玻片(25mm×75mm)。將涂有黏附劑的載玻片放于取樣器內，每天定時取放片，該片在空氣中暴露24h。在取回的載玻片上放一塊甘油膠染色劑，微溶后蓋22mm×22mm的干凈蓋玻片。一般于次日進行鏡檢。
(1)空氣中曝片及鏡檢計數(shù)方法：
①曝片方法：于空氣中暴露涂有軟凡士林黏附劑的載玻片(25mm×75mm)。將涂有黏附劑的載玻片放于取樣器內，每天定時取放片，該片在空氣中暴露24h。在取回的載玻片上放一塊甘油膠染色劑，微溶后蓋22mm×22mm的干凈蓋玻片。一般于次日進行鏡檢。
②鏡檢計數(shù)方法：鏡檢時，將載玻片放在顯微鏡載物臺上，自左至右，慢慢移動推尺，到頭后推尺輕輕上移，將載玻片推上一個新的鏡檢部分，再從右往左移動推尺。以此類推，順序把蓋玻片覆蓋范圍全部看完。詳細記錄真菌的種類與數(shù)量。某醫(yī)院于1989-08-01～1990-07-31每天上午10點暴露涂有凡士林黏附劑的載玻片一張，24h取回，加1滴中性樹膠，蓋22mm×22mm蓋玻片，全蓋玻片鏡檢，記錄真菌孢子、菌絲體數(shù)量。全年曝片365張，共收集真菌孢子10.1112萬個，菌絲體片2367個，已鑒定真菌孢子10.1089萬個，共37個種屬。
(2)空氣中曝皿及鏡檢計數(shù)方法：
①曝皿方法：將帶有消毒培養(yǎng)基的平皿(直徑10cm)在空氣中暴露3～5min。暴露地點可根據(jù)需要而定。暴露完畢，將平皿放置在室溫下或25℃恒溫箱中培養(yǎng)。每天觀察、記錄生長的菌落及鑒定其名稱。平皿應放置在固定地點，觀察時要輕輕取放，防止真菌孢子被震落，造成培養(yǎng)基的污染而影響調查計數(shù)的準確性。一般以每周或每月曝皿一次，時間應與曝片一致，至少以1年為限。
②鏡檢計數(shù)方法：為了防止因某些真菌生長迅速，很快長滿培養(yǎng)皿，影響其他真菌生長，孢子一旦生成，應馬上進行分離鑒定并記錄。一個菌落即作為一種真菌記錄。統(tǒng)計時，菌落與真菌種類要分別計算。我院應用11cm培養(yǎng)皿，馬鈴薯葡萄糖、蔡氏、沙氏三種瓊脂培養(yǎng)基在曝片處、醫(yī)院門前廣場和病區(qū)設置3個固定點曝皿，每點三皿，半月一次，每天上午10點曝皿3min，25℃生化培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每天觀察，記錄菌落數(shù)，直到無新菌落出現(xiàn)為止，挑取菌落用直接壓片或載玻片培養(yǎng)方法于鏡下鑒定，對已鑒定的真菌進行顯微照相，并轉入試管瓊脂斜面培養(yǎng)和保存。全年曝皿24次，共216個瓊脂平皿。收集菌落3012個。
3.真菌的變應原性研究 真菌和真菌孢子作為一種抗原物質，它在人體內產生抗體的能力比較低，可能由于真菌和真菌孢子不產生外毒素，亦無表面抗原存在;或認為真菌孢子的細胞膜上有一層化學穩(wěn)定的物質，使細胞內的抗原成分不易釋放，故激發(fā)抗體產生的功能較低，在臨床上，真菌抗原浸液皮膚試驗的強度與陽性率均明顯低于花粉抗原浸液。
真菌誘發(fā)變態(tài)反應的過程與對結核菌誘發(fā)變態(tài)反應的過程相似，故采用真菌抗原浸液進行皮膚試驗時，既可以出現(xiàn)速發(fā)相皮膚反應，又可以出現(xiàn)遲發(fā)相皮膚反應，有時為雙相反應。我們曾對75例變態(tài)反應性結膜炎病例的皮膚試驗結果進行了觀察，真菌遲發(fā)相反應陽性率明顯高于速發(fā)反應。
所謂致敏真菌，主要是一些植物病原菌和腐生菌。過去多數(shù)人認為真菌的主要抗原有效成分存在于真菌孢子中。后來有人發(fā)現(xiàn)，菌絲和孢子中都有致敏原，國內外許多實驗室對數(shù)種真菌的變應原成分進行過研究，包括抗原的純化、免疫檢測分析等。Gravesen于1979年通過交叉放射免疫電泳分析，發(fā)現(xiàn)交鏈孢霉含有10種以上抗原成分。1980年Yunginger等對交鏈孢霉進行了生化分析，發(fā)現(xiàn)一種抗原性較強的糖蛋白，稱之為Alt-1，其分子量在25000～50000之間。Aukrust等于1979年對芽枝霉的抗原性作了分析，發(fā)現(xiàn)含有60多種蛋白成分，其中有4種屬于主要的抗原決定簇，其余部分為次要抗原決定簇。對其中2種抗原決定簇進行提純，分子量為13000和25000。對10種不同種系的芽枝霉進行抗原性比較，發(fā)現(xiàn)不同種系中主要抗原決定簇的含量差別極大。1980年Kauffman等對煙曲霉的抗原成分進行分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時間長的菌群比培養(yǎng)時間短的菌群抗原性高。1969年Pepys發(fā)現(xiàn)煙曲霉致敏后，發(fā)現(xiàn)其不但可以誘發(fā)機體產生特異性IgE，還可以產生特異性IgG，成為煙曲霉可以誘發(fā)變態(tài)反應性支氣管肺曲菌病發(fā)病的重要依據(jù)。北京地區(qū)某醫(yī)院曾于1984年開始對青霉、交鏈孢霉、曲霉等進行免疫電泳及瓊脂擴散測定，發(fā)現(xiàn)了一些不同的區(qū)帶。1986年對產黃青霉抗原進行了初步分離提純。1986年北京醫(yī)科大學對交鏈孢霉變應原進行了初步活性鑒定，發(fā)現(xiàn)了一種抗原性較強的成分。1987年Reed發(fā)現(xiàn)煙曲霉與土曲霉(A.Terreus)、棒曲霉(A.clavatus)、黑曲霉(A.niger)、黃曲霉(A.flavus)之間均有很高的抗原交叉性。
從上述資料中，我們可以看出，氣傳致敏真菌的抗原性問題是一個極為復雜的問題。不但在不同種系的真菌中變化很大，而且在同一種系的真菌中亦可能存在不同的抗原決定簇。今后如何針對我國的常見致敏真菌的抗原性問題進行研究，將有大量的工作有待探索。
由于真菌的遺傳特性復雜，形態(tài)各異而且多變，決定了它的變應原性的復雜性。真菌的抗原物質絕大部分來自真菌的孢子和菌絲，不同的真菌菌株在有性繁殖期與無性繁殖期兩個不同的階段，在形態(tài)上有明顯差別。不同真菌的變應原性又往往具有相對的交叉反應性。同時，同一種真菌變應原作用于不同的真菌變態(tài)反應病人時，可以出現(xiàn)截然不同的反應。真菌的形態(tài)與發(fā)育又受環(huán)境的影響而變異。不同的接種條件、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度及濕度，均可導致真菌形態(tài)的自動變異，從而影響其抗原性。據(jù)Hoffman (1981)報告，用交鏈孢霉孢子制備的變應原中發(fā)現(xiàn)了8種重要的變應原成分，其中有幾種是用交鏈孢霉菌絲所制備的變應原浸液中所沒有的，提示了真菌孢子和菌絲的變應原成分是不同的。
70年代后期在支氣管哮喘患者中，發(fā)現(xiàn)有16%～28%對煙曲霉變應原浸液皮試呈陽性反應，認為這類病人可能屬于一類特殊的變態(tài)反應類型，稱之為變應性支氣管肺曲菌病。相繼對煙曲霉及其他真菌種類如交鏈孢霉、臘葉芽枝菌等的變應原成分進行了提純和分離。
自從對煙曲霉的變應原進行分離層析以來，并結合臨床進行對照分析，取得了很大進展，例如發(fā)現(xiàn)了煙曲霉的Ag3為不耐熱成分，加熱后可使變應原性明顯降解。Ag7則為引起變應性支氣管肺曲菌病最重要的變應原成分等。目前對真菌變應原的分離提純正在作更深入的研究。在分離方法上采用交叉免疫電泳：可在不同的區(qū)帶上進行更細的層析，取得更純凈的變應原成分。再用克隆化的技術，制備出效價高、特異性強的真菌變應原。這對指導真菌變態(tài)反應的診斷和治療，甚至對闡明真菌變態(tài)反應的發(fā)病及防治機理，可能在分子水平上取得突破性進展。
對于真菌變應原性測定，一種為生物學方法，通過真菌變應原的皮膚試驗或其他激發(fā)試驗，推測其變應原強度與活性。另一種為放射免疫法，即利用放射變應原吸附試驗 (RAST)，從體外測定變應原浸液的變應原強度與活性。因RAST方法需要一定儀器設備，有些試劑國內缺乏，而且價格昂貴，目前用于大量致敏真菌篩選有一定困難。60年代Shelley等人曾發(fā)現(xiàn)速發(fā)相反應患者的嗜堿粒細胞或肥大細胞在體外與特異性抗原相作用時，可引起這些細胞脫顆粒，此后，人嗜堿粒細胞脫顆粒試驗(HBDT)方法經過不斷改進，逐步趨于完善。我們曾采用HBDT、許氏改進方法，用阿利新蘭代替甲苯胺藍染色，可減少染色誤差，用血球計數(shù)板觀察結果，簡便省時，和皮膚試驗有較好的符合率(87%)。應用皮膚試驗和HBDT方法相結合測定真菌變應原性，可以從體內和體外兩個方面反映真菌變應原強度，有助于得出正確結果?？乖涂贵w結合可在任何比例下發(fā)生，但有一個最適數(shù)量的比例(等價帶)，此時，結合反應表現(xiàn)得最強。在HBDT試驗中，進行了幾種單價真菌變應原稀釋度(蛋白質含量)試驗，結果表明10-4變應原稀釋度嗜堿粒細胞脫顆粒較好。因所用真菌種類多，特性各異，其浸液中有效變應原成分和含量也會有所不同，對于每種真菌變應原，選擇它的最佳稀釋度(蛋白質含量)進行HBDT試驗，可能會取得更好的結果。
總之，氣傳真菌種類繁多、分布廣泛，是誘發(fā)支氣管哮喘的重要變應原之一。據(jù)報道美國現(xiàn)已進入市場的商品真菌變應原浸液制劑多達280余種，而我國目前應用于臨床診斷和治療的真菌抗原僅有20～30種，因此深入開展變應原分離提純是今后我國真菌變態(tài)反應學研究的重要任務。
(二)發(fā)病機制
真菌孢子進入正常人的氣道后，完整氣道黏膜上皮的屏障作用對吸入的真菌孢子起著重要的防御功能，將真菌孢子拒之體外，同時氣道內的巨噬細胞的吞噬作用也在清除吸入的真菌及其孢子中起重要作用，因此真菌很少能夠成為病原體。由于氣道黏膜上皮的屏障作用有效地限制了真菌抗原與氣道相關的淋巴組織接觸。因此，血循環(huán)中針對真菌的特異性IgE水平通常較低、用雙向免疫擴散法及ELISA-IgG滴定法測定沉淀素均陰性。而對于特應性素質的病人來說，當氣道反復不斷地接觸真菌孢子或菌絲體抗原時，在氣道巨噬細胞吞噬真菌的同時，氣道內的免疫系統(tǒng)還將其作為外來抗原進行提呈處理，由此可以產生針對真菌的特異性IgE而導致氣道的致敏，誘發(fā)呼吸道的變態(tài)反應致使哮喘發(fā)作。曲霉、青霉、芽枝菌、交鏈孢霉、木霉、毛霉、根霉、梨頭霉、共頭霉、擔子菌及念珠菌等真菌孢子均可作為抗原而產生特異性IgE，并可引起氣道變應性炎癥。
真菌變應性哮喘的發(fā)病情況
1.發(fā)病概況 由于實驗技術上的限制和無相應的診斷標準，目前國內外對真菌變應性哮喘的發(fā)病率尚未提出一種確切的數(shù)據(jù)。由于真菌過敏的臨床表現(xiàn)比花粉過敏復雜得多，它不一定有明顯季節(jié)性，各種真菌間的交叉反應又很高，其發(fā)病率統(tǒng)計，各地差異較大。北京地區(qū)醫(yī)院通過真菌皮膚試驗陽性率21%，國內有人報告真菌變應原皮膚試驗陽性率高達70%。近年來各種職業(yè)性真菌變態(tài)反應的發(fā)生率增高，據(jù)美國人口統(tǒng)計局統(tǒng)計，美國農業(yè)人口總數(shù)在800萬以上，其中1/4經常接觸谷物，有1/2～3/4的病人在谷塵中暴露，由于存放過久的谷塵中含有較多的真菌，許多由此引起真菌性哮喘、急性或慢性農民肺等。我國農業(yè)人口數(shù)十倍于美國，且以手工操作為主，真菌變態(tài)反應必然是十分重要的問題。今后隨著農業(yè)、畜牧飼養(yǎng)業(yè)、釀造及發(fā)酵業(yè)、食品加工、蘑菇種植、制藥業(yè)的發(fā)展，以及生活環(huán)境中空調器的使用，密閉式建筑物的增多，均可能進一步導致真菌變態(tài)反應的增加。
Jimenez Diaz及Sanchez Cuenca發(fā)現(xiàn)西班牙對室內塵土過敏的病人中，實際上大多是對塵土中的真菌過敏。1939年Wittich發(fā)現(xiàn)谷塵中的銹菌及黑粉菌孢子是明尼蘇達州哮喘病人的主要致敏病原。Bruce發(fā)現(xiàn)對交鏈孢霉過敏的24個病人中，有15例發(fā)病與空氣中交鏈孢霉的計數(shù)高峰期相吻合。70年代以來，Reed及Salvaggio等就致敏真菌的抗原分離提純做了大量工作。對多種真菌職業(yè)性變態(tài)反應作了深入研究。1983年Crook就念珠菌對人體免疫功能的影響以及念珠菌過敏問題作了多方面的探討。1957年北京地區(qū)醫(yī)院開始進行真菌變態(tài)反應的臨床及實驗室研究。30多年來，通過數(shù)以萬計病人的臨床診斷和治療及實驗室空氣中真菌曝片、曝皿培養(yǎng)等調查，對我國致敏真菌的種類、飄散規(guī)律、檢驗方法、抗原制備、真菌鑒定、菌種保存、抗原提純等做了大量工作。對于真菌所致的支氣管哮喘、過敏性肺炎、肺泡炎、變應性肺支氣管曲菌病取得了一些實踐經驗，為今后真菌變態(tài)反應的綜合研究，創(chuàng)造了必要的條件。
2.年齡與真菌過敏發(fā)病率的關系 研究發(fā)現(xiàn)對真菌過敏的發(fā)病率與患者的年齡有密切關系。通過對將10年作為一個年齡段的調查證實，10歲以下年齡段的真菌過敏發(fā)病率最高，通常年齡越小，對真菌的過敏的發(fā)生率就越高，而隨著年齡的增長，對真菌的敏感性可迅速下降。這種現(xiàn)象與花粉過敏形成了鮮明的對照。在低齡組的各種真菌皮試陽性率通常與本地區(qū)空氣中真菌孢子的種類和含量較為一致，提示了當?shù)乜諝庵姓婢恼{查結果可以作為低齡組兒童進行真菌皮試的參考。Koivikko等證實了哮喘兒童對真菌的過敏發(fā)生率相對較高，同時該結果也與兒童血清中放射性變應原吸附試驗的特異性IgE滴度相對較高是一致的。真菌性抗原有時可對嚴重哮喘患者構成嚴重威脅，是一種重要的哮喘誘發(fā)因素，嚴重時可導致兒童及青年的哮喘猝死。Beaumont等對成人哮喘患者的真菌變應原提取液進行皮試調查，其陽性率小于5%，而且往往發(fā)生在對其他空氣中的變應原也過敏的哮喘患者。
低齡組患兒對真菌過敏的發(fā)生率較高的原因可能與真菌廣泛存在于空氣中(特別是室內的流通性較差的空氣)有關，而且各種真菌之間有著較高的抗原交叉性，因此從新生兒起就隨時有真菌致敏的機會，同時由于嬰幼兒室內活動較多，致敏的機會就更大于花粉。一旦隨著年齡增長，對真菌敏感性迅速下降。這可以部分解釋世界各地有關真菌過敏發(fā)生率的較大差異。免疫記憶細胞可使氣道產生針對真菌的特異性抗體如分泌性免疫球蛋白A(sIgA)，使機體對真菌的敏感性迅速下降。氣道中真菌孢子的及時清除，減少了這些抗原暴露于支氣管相關淋巴組織(bronchial-associated lymphoid tissues)，使免疫反應減輕。