慢性乙型肝炎至今尚未找到徹底治愈的藥物，嚴重威脅著人類的健康。近年來，很多學者正努力尋找抗HBV新策略。通過多年的積累，人們逐漸發(fā)現(xiàn)隱藏在宿主細胞內的HBVcccDNA是病毒賴以復制生存的關鍵。本屆AASLD年會上，經(jīng)過學術評議委員會的嚴格篩選，AASLD評選出了本年度關于“乙型肝炎新治療和新靶點”的6項重要研究，RNA干擾技術的應用已占據(jù)了半壁江山。令人驚訝的是，本屆AASLD主席GyongyiSzabo女士特別邀請到RNA干擾技術之父、2006年諾貝爾生理學/醫(yī)學獎得主——CraigC.Mello教授做主旨報告，相信這并非純粹的巧合。目前，這些RNA干擾藥物都取得了較好的臨床前研究結果，期待在不久的未來，這一新型抗HBV藥物將徹底解決慢性乙型肝炎這一難題。

　　RNA干擾藥物ARC-520在動物模型中可有效降低cccDNA水平

　　ARC-520是以全部cccDNA的轉錄為靶點的RNA干擾性藥物。前期的研究表明，HBV感染患者應用單劑ARC-520治療后，病毒抗原水平可持續(xù)降低1個月以上。美國Arrowhead研究公司W(wǎng)ooddell等在AASLD年會上報告了應用多劑ARC-520對HBV感染黑猩猩肝臟HBVDNA和RNA的效果

　　Wooddell博士介紹說：“我們在9只HBV感染的黑猩猩（5只雄性，4只雌性）中觀察了ARC-520治療（每月1次，共6~11次）的效果。HBeAg陽性組（n=5）與陰性組（n=4）的基線血清DNA分別為為8~9logIU/mL和≤3logIU/mL。在給予ARC-520之前，均應用NA治療8~24周。”

　　在基線、完成NA導入和ARC-520治療后進行肝活檢，應用qPCR檢測HBVDNA和cccDNA，應用RT-qPCR檢測前核心/核心RNA（C探針）和總HBVRNA（總探針）。

　　目前的研究表明：?①應用核苷（酸）類似物（NA）治療的HBeAg陽性黑猩猩加用ARC-520后，可使肝臟總DNA和cccDNA水平進一步降低；②ARC-520可使HBVRNA和抗原減少，而NA無法實現(xiàn)；③對于慢性HBV感染者，尤其是HBeAg陰性者，HBVDNA整合是HBsAg持續(xù)陽性的重要原因。

　　魯鳳民教授：CRISPR/Cas9系統(tǒng)及RNAi方法可促使cccDNA清除

　　我國北京大學醫(yī)學部病原生物學系魯鳳民教授課題組利用RNA干擾技術設計出一種新型基因組編輯工具CRISPR/Cas9系統(tǒng)，它可有效破壞HBV表達模板，且無明顯的細胞毒性。這項研究在今年的8月28日，已發(fā)表在WorldJGastroenterol雜志上。

　　研究人員總共設計出了對抗HBVA-D基因型的15種gRNAs，選出了覆蓋HBV調控區(qū)域的11個雙gRNAs組合。結果顯示所有gRNAs都可以顯著減少培養(yǎng)物上清液中HBsAg或HBeAg生成，這取決于gRNA對抗的區(qū)域。所有的雙gRNAs都可以有效抑制HBVA-D基因型生成HBsAg和/或HBeAg，與單gRNA相比，雙gRNAs抑制HBsAg和/或HBeAg生成的效力大大提高。

　　此外，通過PCR直接測序技術，他們證實了這些雙gRNAs可通過除去兩gRNAs切割位點之間的片段來破壞HBV表達模板。更重要的是，gRNA-5和gRNA-12組合不僅可以有效抑制HBsAg和/或HBeAg生成，還能夠破壞HepAD38細胞中的cccDNA儲存庫。

　　魯鳳民教授表示：“我們的研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效破壞HBV表達模板，并且有很好的安全性。它可能成為根除慢性HBV感染患者中持續(xù)存在的HBVcccDNA的一種有效手段。”

　　ALN-HBV可介導強力持久的HBV沉默

　　以HBV基因組為靶點的RNA干擾，有望通過有效降低所有病毒基因產(chǎn)物，包括HBsAg等病毒抗原的表達，實現(xiàn)HBV感染的“功能性治愈”。美國Alnylam制藥公司Sepp-Lorenzino等的研究表明，針對肝細胞的siRNA偶聯(lián)物—ALN-HBV以HBV基因組內的高度保守區(qū)為靶點，可介導特異、強力和持久的HBV病毒轉錄沉默和HBsAg表達沉默。

　　ALN-HBV是一種化學穩(wěn)定性增強、針對肝細胞的GalNAc-siRNA偶聯(lián)物，其靶點為HBVX蛋白開放閱讀框（ORF）的一個位點，因此，可針對所有四種HBVRNA轉錄體，通過RNA干擾發(fā)揮降解作用。生物信息學分析表明，它與合并A-J基因型HBV的全長病毒基因組的序列同源性>95%，對宿主基因的脫靶活性非常低。

　　在AAV-HBV小鼠模型中，以3mg/kg單次皮下注射ANL-HBV后10~15天，血漿HBsAg平均下降1.6logIU/mL（最多下降3.6logIU/mL），在每周一次3mg/kg治療3次后，平均HBsAg沉默>2.9logIU/mL，HBsAg低于定量水平（<0.05ng/mL），在最后一劑后，HBsAg沉默持續(xù)超過100天。此外，在大鼠藥代動力學和肝臟暴露的研究結果顯示有良好的耐受性。

　　目前，研究者正在進行其他藥理學研究，包括ALN-PDL的聯(lián)合研究，PDL是針對肝細胞內PD-L1的一種RNA干擾藥物，ALN-PDL有望增強肝內的HBV特異性細胞免疫，從而提高局部對HBV感染的免疫控制，同時避免全身免疫檢查點阻斷的免疫毒性。

　　延伸閱讀——RNA干擾的作用機制

　　病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內，并利用宿主細胞進行轉錄時，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應，其胞質中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA（大約21～23bp），即siRNA。siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內一些酶（包括內切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結合，RISC具有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNA干擾（RNAi）的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。

　　RNAi發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細胞內。需要說明的是，由于dsRNA抑制基因表達具有潛在高效性，任何導致正常機體dsRNA形成的情況都會引起不需要的相應基因沉默。所以正常機體內各種基因有效表達有一套嚴密防止dsRNA形成的機制。

　　RNAi具有以下特征：

　　1.RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制；

　　2.RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應的單個內源基因的mRNA；

　　3.RNAi抑制基因表達具有很高的效率，表型可以達到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNA分子（數(shù)量遠遠少于內源mRNA的數(shù)量）就能完全抑制相應基因的表達，是以催化放大的方式進行的；

　　4.RNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限，在不同細胞間長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳等特點；

　　5.dsRNA不得短于21個堿基，并且長鏈dsRNA也在細胞內被Dicer酶切割為21bp左右的siRNA，并由siRNA來介導mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳動物中誘導特異的RNA干擾，而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑和凋亡；

　　6.ATP依賴性：在去除ATP的樣品中RNA干擾現(xiàn)象降低或消失顯示RNA干擾是一個ATP依賴的過程?？赡苁荄icer和RISC的酶切反應必須由ATP提供能量。