絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMO)是最常見的與年齡相關(guān)的骨量丟失性疾病，與卵巢激素缺乏有關(guān)。雌激素治療可有效提高并維持絕經(jīng)后婦女骨密度。研究發(fā)現(xiàn)雌激素通過骨細胞上的雌激素受體（ER）和雌激素相關(guān)受體alpha（ERRα）介導(dǎo)調(diào)節(jié)骨代謝。Kurt等發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女ERα基因多態(tài)性與骨密度明顯正相關(guān)。類固醇受體輔助激活因子3（SRC-3) 是一個重要的ERα輔助激活因子。ERα陽性的人乳腺癌細胞中敲減SRC-3后可以抑制雌激素刺激下的細胞增殖和生存。Wang等研究發(fā)現(xiàn)SRC-3與ERα特異性結(jié)合促進人成骨樣細胞（MG-63）增殖和分化，抑制細胞死亡。一項針對高加索男性研究發(fā)現(xiàn)，SRC-3等位基因突變與腰椎骨密度明顯正相關(guān)。提示SRC-3可能是骨代謝過程的一個重要調(diào)節(jié)因子。另外，核受體輔助激活因子PGC-1α在多種細胞系中能明顯誘導(dǎo)ERRα mRNA表達，說明體內(nèi)ERRα可能受到PGC-1α調(diào)節(jié)。目前，關(guān)于SRC-3和PGC-1α是否參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女異常骨代謝的發(fā)展過程未見明確報道。因此，本研究目的是評估絕經(jīng)后婦女骨組織中SRC-3和PGC-1α的表達及臨床意義。

　　臨床材料與方法

　　研究對象

　　選擇2012年6月至2013年9月期間于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院骨科醫(yī)院關(guān)節(jié)外科住院的全髖關(guān)節(jié)置換患者20例，平均年齡(62.25±10.91)歲，其中16例為髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，2例為發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良，2例為股骨頭壞死，術(shù)前雙能X線（DEXA）骨密度儀測量受試者腰椎1～4（L1-4）和左側(cè)股骨頸骨密度，根據(jù)WHO頒布的診斷標準，分為試驗組（腰椎BMD T評分＜–2.5，10例）和對照組（T評分＞–1.0，10例），術(shù)中取一側(cè)開路器切除的粗隆部位松質(zhì)骨，放于液氮罐中保存。記錄入選者年齡、絕經(jīng)年齡、身高、體重，計算體重指數(shù)（BMI）=體重/身高2。本研究經(jīng)廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準，所有受試者都簽有知情同意書。

　　病例選擇標準

　　診斷標準

　　參照WHO推薦的骨質(zhì)疏松癥診斷標準及中國老年學(xué)學(xué)會骨質(zhì)疏松委員會制定的《中國人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標準（第二稿）》。

　　納入標準

　?、俜螾MO診斷標準，來我院就診前未接受過系統(tǒng)治療，簽署知情同意書并能接受試驗者。②屬絕經(jīng)后致病的患者；③愿意接受調(diào)查的患者。符合以上各條納入試驗。

　　排除標準

　?、俨环显\斷標準和納入標準的患者；②本次就診前接受藥物治療的患者；③既往有糖尿病、甲狀旁腺功能亢進、甲狀旁腺功能減退、肝腎疾病、癌癥、腫瘤及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，強直性脊柱炎等免疫系統(tǒng)疾病的患者；④其它影響骨代謝的疾?。汗侨芙?、化膿性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)結(jié)核、脊柱結(jié)核等；⑤缺乏依從性的患者。符合以上任意1條排除試驗。

　　臨床數(shù)據(jù)收集

　　記錄年齡、身高、體重，計算體重指數(shù)（BMI）；檢測血清骨轉(zhuǎn)換指標PINP和β-CTX濃度；采用美國GE公司生產(chǎn)的Lunar Prodigy雙能X線骨密度儀（DEXA），檢測受試者腰椎（L1-4）的BMD。每次檢查前均用腰椎模型進行儀器精密度質(zhì)控測試，腰椎的CV分別為0.71%，體模測定的長期CV為0.29%。

　　主要試劑和儀器

　　TRIZOL購于Sigma公司，PrimeScript? RT reagent Kit WithgDNA Eraser試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒購于TaKaRa公司，SRC-3, PGC-1α和GAPDH引物由上海英濰捷基合成，RIPA 細胞裂解液購于Sigma公司，兔抗SRC-3 (5E11) Rabbit mAb CST、鼠抗ST1202Anti-PGC-1α Mouse mAb (4C1.3) Millipore #ST1202-1SET、GAPDH(14C10) Rabbit mAb CST購于CST公司，其它生化試劑如氯仿、無水乙醇、異丙醇等均為進口或國產(chǎn)分裝試劑。高速低溫離心機（Eppendorf公司），Merinton MA1000微量分光光度計（Bio-Rad公司），熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司），電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)印儀（Bio-Rad公司），NaNoDrop微量核酸定量儀（Thermo公司）。

　　指標檢測

　　熒光實時定量RT-PCR檢測骨組織中SRC-3和PGC-1α等mRNA的表達：① 樣品總RNA提取：將骨組織塊直接放入研缽中，加入液氮，研磨組織，將研磨后的組織轉(zhuǎn)入離心管，按照100mg組織/ml加入Trizol。加入200ul氯仿（按0.2ml氯仿/1ml Trizol），蓋緊管蓋，充分振蕩15s。12000rpm，4℃離心15min，小心吸取上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，切勿吸到中間層，加入500ul 異丙醇（按0.5ml異丙醇/1 ml Trizol），混勻后，室溫放置l0min。12000rpm，4℃離心15min，小心棄去上清，保留RNA沉淀。按1ml 75%乙醇/1mlTrizol，加入100ul 75%乙醇洗滌RNA沉淀，7500 rpm，4℃離心5min，小心棄去上清，保留RNA沉淀。打開管蓋，讓RNA沉淀自然干燥，其后加入30 ul RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。65度水浴10min，使RNA充分溶解。②酶標儀檢測RNA純度及含量：含量在1.5～2.0 g/L，OD260/280在1.8～2.0之間。③ 逆轉(zhuǎn)錄及Real-timePCR：以總RNA為模板，從Genebank中獲得序列，采用PrimerPremier 5.0設(shè)計熒光定量PCR引物，按TaKaRa PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（D6210A）試劑盒說明進行cDNA第一鏈的合成。按照SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)，94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，60℃預(yù)變性30s，30個循環(huán)。用特異性引物分別擴增SRC-3、PGC-1α、CBP/P300、P/CAF、OPN、Osteocalin和18s。制作標準曲線，根據(jù)標準曲線擴增效率的一致性，用2-ΔΔCt法分別計算SRC-3, PGC-1α mRNA的相對表達量。

　　Western blotting檢測骨組織中SRC-3和PGC-1α蛋白表達：①組織分析天平稱重后按每mg組織3.5μl裂解液，并加入Cocktail（50μl裂解液1μl）蛋白酶抑制劑，PMSF（100μl裂解液1μl），在冰浴下研缽中勻漿，置于冰上裂解30 min，每10 min移液器吹打一次。將組織碎片和裂解液移至1.5mLEP管中。將含樣品的1.5mL離心管，4℃ 12000g/min高速離心30 min。將上清小心轉(zhuǎn)移到干凈無菌離心管中，-70度保存。② BCA法測定各蛋白濃度，將2 μg/μlBSA標準品按下表用水稀釋配制不同濃度的BSA標準品，檢測范圍0.02～2 μg/μl。③ 配制12%分離膠后制備樣品，上樣后進行SDS-PAGE電泳，5%濃縮膠70V，8%分離膠110V，不恒定電流，約1.5 h。把分離膠放入電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（恒壓200 mA，120 min）。取出PVDF膜，去離子水洗滌，洗液平衡后用5%脫脂奶粉(用TBST稀釋)室溫封閉60min。分別進行一抗、二抗孵育，洗膜、發(fā)光后進行曝光顯影。④采用WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件Gelpro32來分析X光膠片中蛋白條帶面積的灰度值并進行比較。以GAPDH作為內(nèi)參，計算SRC-3和PGC-1α蛋白相對表達量。

　　統(tǒng)計學(xué)方法

　　采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用均數(shù)±標準差表示，兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　結(jié)  果

　　受試者的一般臨床資料比較

　　試驗組和對照組受試者的年齡、BMI、P1NP、CTX、腰椎BMD、腰椎BMD T-score、股骨頸BMD、股骨頸BMD T-score均服從正態(tài)分布（P＞0.05）。與對照組相比，試驗組患者年齡明顯偏低（P=0.001），腰椎BMD明顯下降（P＜0.001），均具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

　　絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者股骨骨組織中SRC-3和PGC-1α等mRNA表達

　　與對照組相比，試驗組PGC-1α、SRC-3、CBP/P300、P/CAFmRNA表達水平下降（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05），試驗組OPNmRNA表達水平升高（P＜0.01）。與對照組相比，試驗組Osteocalin mRNA表達有下降趨勢，兩組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

　　絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者股骨骨組織中SRC-3和PGC-1α蛋白表達

　　與對照組相比，試驗組SRC-3蛋白表達[（53.23±0.55）%（P=0.037）]和PGC-1α蛋白表達[（72.17±0.64）%（P=0.003）]明顯下調(diào)。

　　討  論

　　SRC-3屬于p160類固醇受體輔助激活因子家族成員，此外，該家族還包括SRC-1和SRC-2，研究發(fā)現(xiàn)它們都是調(diào)節(jié)乳腺癌細胞增殖以及ERα轉(zhuǎn)錄活性的重要調(diào)節(jié)因子。另外，SRC家族每個成員均能調(diào)節(jié)雌激素依賴的ERα靶基因的表達。先前的兩項研究檢測了正常小鼠、去卵巢小鼠以及去卵巢后用雌激素治療小鼠骨顯型SRC-1或SRC-2基因敲除的骨量變化情況。研究發(fā)現(xiàn)SRC-1基因敲除雌性小鼠松質(zhì)骨量減少且對雌激素促進骨形成的作用產(chǎn)生抗性，說明SRC-1在雌激素對骨形成的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。Jeong研究發(fā)現(xiàn)SRC-2基因敲除雌性小鼠子宮功能受到影響，且闡明了SRC-2可能是通過調(diào)節(jié)ER、Wnt信號通路、BMP信號通路來調(diào)控子宮功能。類似地，M?dder等研究發(fā)現(xiàn)SRC-1基因敲除雌性小鼠松質(zhì)骨量增加且骨骼表達PPARγ能力明顯下降。無論在乳腺癌細胞，還是在人成骨細胞中，SRC-3是ERα的首選激活因子。核受體輔助因子PGC-1α是1998年發(fā)現(xiàn)的一種新的核受體轉(zhuǎn)錄共激活因子。研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α在環(huán)磷腺苷（cAMP）誘導(dǎo)的成骨細胞特異基因表達中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。另外，PGC-1α在多種細胞系中能明顯誘導(dǎo)ERRα mRNA表達，說明體內(nèi)ERRα可能受到PGC-1α調(diào)節(jié)。Wang等報道ERRα和PGC-1α相互作用可以調(diào)節(jié)成骨細胞中成骨特異基因Osteocalcin的表達。因此，我們預(yù)測SRC-3和PGC-1α均能調(diào)節(jié)骨代謝和骨密度。目前，關(guān)于SRC-3和PGC-1α是否參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女異常骨代謝的發(fā)生過程尚無文獻報道。在本研究，我們采集因關(guān)節(jié)疾病行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的伴有絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的大轉(zhuǎn)子處骨組織，發(fā)現(xiàn)骨組織中SRC-3和PGC-1α基因和蛋白的表達水平明顯低于不伴有骨質(zhì)疏松癥的患者。

　　對骨組織標本進行QPCR研究中，除SRC-3和PGC-1α基因外，還對CBP/P300、P/CAF、OPN和OsteocalinmRNA進行了分析，發(fā)現(xiàn)試驗組CBP/P300和P/CAFmRNA表達低于對照組，而OPN mRNA表達高于對照組，兩組OsteocalinmRNA表達水平無差異。文獻報道，當(dāng)配體與ER結(jié)合后，SRC首先募集到結(jié)合區(qū)域，進而與CBP/P300，P/CAF等輔助因子相互作用，共同增強核受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活；當(dāng)配體與ERR結(jié)合后，PGC-1首先募集到結(jié)合區(qū)域，進而與SRC和CBP/P300等輔助因子相互作用，共同增強核受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。本研究結(jié)果證實了這些核受體輔助因子之間的輔助激活作用。最近一些研究報道OPN在絕經(jīng)后婦女和去卵巢大鼠中起負向調(diào)節(jié)骨代謝作用。與本研究結(jié)果一致。對于成骨特異基因的表達Osteocalin的表達兩者確無明顯差異，與血清學(xué)研究結(jié)果一致，原因可能是Osteocalin一般作為骨形成早期的標記物，隨著年齡的變化和骨更新率的變化會改變，而選取的受試者因年齡不同、絕經(jīng)時間不同的差異，可能會影響Osteocalin的分泌，這也是血清Osteocalin不能作為評價骨轉(zhuǎn)換水平的穩(wěn)定指標的原因。

　　綜上所述，本研究在分子水平觀察了SRC-3和PGC-1α在PMW患者骨組織中的表達狀態(tài)，說明二者可能參與PMO患者異常骨代謝的病理過程，然而，本部分研究只是從現(xiàn)象上闡述了SRC-3和PGC-1α在PMO中的變化，下一步研究將繼續(xù)探索SRC-3和PGC-1α在骨代謝中的功能和調(diào)控機制，為深入理解PMO的發(fā)病機理和探索新的治療方法提供依據(jù)。