19世紀(jì)50年代，在瘧疾流行區(qū)域，Burkitt發(fā)現(xiàn)少數(shù)非洲兒童患有一種B細(xì)胞淋巴瘤（后被命名為Burkitt淋巴瘤）；此后，在1964年，Epstein、Achong和Barr在培養(yǎng)的Burkitt淋巴瘤細(xì)胞中觀察到一種皰疹病毒[1]，即EB病毒（Epstein-Barrvirus,EBV）。隨后，在多種疾病和腫瘤中均檢測到EB病毒，如鼻咽癌、胃癌、Hodgkin's淋巴瘤、傳染性單核細(xì)胞增多癥和獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS）患者的口腔毛狀白斑癥等[2，3]。世界衛(wèi)生組織將EB病毒歸為第一類致瘤病毒，全球每年新增約200,000與EB病毒直接相關(guān)的腫瘤病例，其中在新增的8200例Burkitt腫瘤、930,000例胃癌、62,000例Hodgkin腫瘤和80,000例鼻咽癌中，與EB病毒相關(guān)的病例數(shù)目依次為6700、84,000、28,000和78,000[4，5]。EB病毒在人群中感染非常普遍，全世界95%左右的成年人被EB病毒感染[6]，大部分EB病毒感染發(fā)生在嬰幼兒時期；但并不引起癥狀或只產(chǎn)生非特征性的癥狀，而是建立終生潛伏感染狀態(tài)[2，7]。EB病毒作為一種致病病毒，由于其感染的廣泛性和普遍性，全球相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)家們一直致力于EB病毒疫苗的研發(fā)，以預(yù)防和治療EB病毒感染所引起的各種疾病和腫瘤，通過將病毒蛋白以不同形式組合形成重組蛋白，極大限度地阻斷EB病毒感染和殺傷感染細(xì)胞，是EB病毒疫苗研究的發(fā)展方向，同時結(jié)合生物材料、納米材料組裝功能疫苗，也為EB病毒疫苗的研究注入新的活力；而EB病毒的感染具有強烈地種屬特異性，只感染人類，導(dǎo)致缺乏有效地動物模型用于臨床前評估疫苗預(yù)防和治療效果，這也是目前EB病毒疫苗研究的難點。本文通過綜述以EB病毒糖蛋白gp350為基礎(chǔ)的多種預(yù)防性疫苗的臨床試驗結(jié)果和以病毒核抗原EBNAs、膜蛋白LMPs為免疫治療靶點疫苗的治療效果，以及相應(yīng)動物模型的構(gòu)建和基礎(chǔ)研究方面的成果，為研發(fā)新型的EB病毒疫苗提供潛在的解決方案。

 

EB病毒是一種含172kb基因組的人類γ皰疹病毒，其主要經(jīng)體液接觸途徑進(jìn)入人體；然后通過病毒包膜糖蛋白gp350與B淋巴細(xì)胞表面的CD21結(jié)合、以及糖蛋白gp42與人白細(xì)胞抗原結(jié)合而感染B淋巴細(xì)胞[2，8]，EB病毒還能感染其它細(xì)胞，如上皮細(xì)胞，在某些情況下還能感染T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和單核細(xì)胞等[9]。EB病毒感染人體后，刺激免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，首先產(chǎn)生γ-干擾素協(xié)同NK細(xì)胞抑制病毒感染的B淋巴細(xì)胞的復(fù)制，隨后通過特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）殺傷被感染細(xì)胞。目前認(rèn)為T細(xì)胞免疫應(yīng)答對控制EB病毒感染起決定性作用，也為設(shè)計疫苗刺激機體CTL應(yīng)答來治療EB病毒相關(guān)疾病提供了依據(jù)。

 

EB病毒感染早期一般無癥狀或產(chǎn)生非特征性癥狀，但感染青少年或年輕人后，可能導(dǎo)致單核細(xì)胞增多癥；大概1%的EB病毒感染者會出現(xiàn)并發(fā)癥，如腦炎、肝炎、溶血性貧血或血小板減小癥。EB病毒與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并具有地域性地特點，如鼻咽癌主要發(fā)生在我國南方地區(qū)，50歲以上人群鼻咽癌發(fā)病率高達(dá)50/100,000；EB病毒相關(guān)的Burkitt淋巴瘤主要發(fā)生在位于赤道的非洲國家和新幾內(nèi)亞[4，5]。

 

EB病毒侵染細(xì)胞后，在復(fù)制感染過程中共表達(dá)9種蛋白，其中包括6種病毒核抗原（EBNA1,EBNA2,EBNA3a,EBNA3b,EBNA3c和EBNA-LP）以及三種潛伏膜蛋白（LMP1,LMP2A,LMP2B）；還有兩種EBV編碼的核糖核酸（EBER1和EBER2）[10]。EB病毒的潛伏感染形式可分為潛伏III期、潛伏II期和潛伏I期，各個時期表達(dá)的蛋白有所不同，也分別與不同種類腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)；潛伏III期表達(dá)：EBNA1,EBNA2,EBNA3,LMP1,LMP2，與淋巴瘤的發(fā)生相關(guān)；潛伏II期表達(dá)：EBNA1,LMP1和LMP2，與Hodgkin's淋巴瘤和非Hodgkin's淋巴瘤有關(guān)；潛伏I期表達(dá)：EBNA1，與Burkitt淋巴瘤和胃癌密切相關(guān)。正由于各時期所表達(dá)蛋白不同和致瘤種類各異，因此，在研究特定腫瘤疫苗時，能夠有更強地針對性，也可以將兩種或多種蛋白整合，以提高疫苗治療相關(guān)疾病和腫瘤的幾率[8,11]。EBNA1是EB病毒潛伏感染時表達(dá)的一種病毒核抗原，其能調(diào)節(jié)EB病毒的復(fù)制，增強病毒基因的轉(zhuǎn)錄；并能維持病毒基因組的穩(wěn)定性，使病毒能以附加體的形式穩(wěn)定存在于被感染的細(xì)胞內(nèi)。EBNA1包含多個CD4T細(xì)胞的靶向表位，可由特異性HLAII類分子呈遞給T細(xì)胞，從而使EBNA1成為治療EBV相關(guān)疾病潛在的靶點。LMP1是EB病毒潛伏蛋白中研究最透徹的，其表達(dá)可誘導(dǎo)EB病毒感染和初始B細(xì)胞活化等一系列變化。包含HLAA2限制性LMP1肽段的多肽疫苗，能夠有效誘發(fā)強的CTL應(yīng)答，并在HLAA2/Kb小鼠體內(nèi)逆轉(zhuǎn)表達(dá)LMP1的腫瘤。LMP2是一種具有促進(jìn)生長活性的膜信號蛋白，包含CD8T細(xì)胞靶向表位，由HLAI類分子呈遞給T細(xì)胞。在多數(shù)EB病毒相關(guān)惡性疾病中，均表達(dá)EBNA1、LMP1和LMP2，甚至只表達(dá)該三種蛋白，而且這三種蛋白都可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生CTL反應(yīng)；在治療性疫苗的設(shè)計和研發(fā)中，通過對這編碼這三種蛋白基因進(jìn)行相應(yīng)修飾和組合，誘發(fā)特異性CTL應(yīng)答，達(dá)到治療目的。

 

EB病毒疫苗的設(shè)想，最早可追溯到1976年，Epstein[12]首先提出用疫苗預(yù)防EB病毒相關(guān)的惡性腫瘤或減少其發(fā)病率。目前，大部分防治EB病毒感染疫苗的研究集中于EB病毒的包膜糖蛋白gp350，不僅是因為EB病毒通過gp350與CD21結(jié)合感染細(xì)胞；而且gp350是EB病毒和被感染細(xì)胞上最豐富的糖蛋白，同時也是產(chǎn)生中和性抗體以抵御病毒感染首要的靶標(biāo)。2007年，Sokal等[13]制備的重組gp350疫苗進(jìn)行了II期臨床試驗，試驗對象包括181位未被EB病毒感染、且身體健康的年輕人；試驗結(jié)果表明：該疫苗預(yù)防由EB病毒感染引起的傳染性單核細(xì)胞增多癥的有效率達(dá)到78%，并且產(chǎn)生的抗gp350抗體在體內(nèi)留存時間超過18個月，同時該疫苗具有良好的安全性和免疫原性[14]，目前已著力于III期臨床試驗的設(shè)計[4]；但是該重組疫苗不能有效預(yù)防無癥狀的EB病毒感染。2009年，Rees等[15]以慢性腎功能衰竭、只能等待器官移植的患者為研究對象，進(jìn)行了gp350疫苗I期臨床試驗，結(jié)果表明該疫苗具有良好地生物活性和免疫原性；試驗過程中發(fā)現(xiàn)，由于研究對象對該疫苗的特定反應(yīng)，使得從初次接種該疫苗到最終實施器官移植的中值時間為24周，從而延遲了移植手術(shù)的進(jìn)行；后續(xù)臨床試驗需要在接種疫苗時使用配套改進(jìn)地佐劑，以縮短從初次接種到移植的時間，以降低移植后患者體內(nèi)EB病毒載量和患移植后淋巴增生性紊亂疾病的幾率。

 

2013年，Cui等[16]在構(gòu)建gp350載體的時候，以(Gly4Ser1)3為連接體將兩段完全一樣的gp350序列分割開；隨后添加釀酒酵母GCN4亮氨酸拉鏈序列，利用其自連作用使gp350二聚體最終形成四聚體蛋白；并且所采用的gp350僅包括其前470個氨基酸序列，但包含有CD21的結(jié)合位點。在研究該四聚體gp3501-470的免疫原性和有效性時，以單體gp3501-470為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：四聚體形式的gp350，其免疫原性比單體gp350強25倍，與CD21結(jié)合的效率比單體形式高24倍；實驗結(jié)果也表明，所制備的四聚體gp350疫苗，能夠有效預(yù)防EB病毒感染宿主細(xì)胞，從而具有作為預(yù)防性疫苗的潛力。EB病毒的預(yù)防性疫苗主要以gp350為靶抗原，通過接種后刺激機體產(chǎn)生中和性抗體以阻斷病毒感染通路。確保疫苗的安全性和免疫原性是疫苗研發(fā)的首要原則，從上述臨床結(jié)果可以看出，gp350疫苗兼具良好的安全性和免疫原性，具有較好的預(yù)防效果；但對于無癥狀地或特定地EB病毒感染者不能有效地預(yù)防，使得疫苗的適用范圍大大減??；具有更強免疫原性的多聚體gp350疫苗，或許是好的解決方案。

 

 

EB病毒的核抗原EBNAs和膜蛋白LMPs能夠誘發(fā)宿主特異性地細(xì)胞免疫反應(yīng)，為免疫治療提供了基礎(chǔ)。目前正在研究中的疫苗主要以LMP1,LMP2,EBNA1和EBNA3為靶抗原，通過單一或多個蛋白組合，構(gòu)建病毒疫苗；接種后，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，通過特異性地細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞作用清除表達(dá)相應(yīng)靶抗原的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療效果。

 

 

2003年，Duraiswamy等[17]通過重組一個痘病毒疫苗，其包含有編碼源于LMP1的HLAA2-限制表位的多肽蛋白；以EB病毒相關(guān)的Hodgkin's疾病和鼻咽癌患者為對象的臨床前試驗結(jié)果表明該疫苗能夠有效地被正常人的LMP1特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）識別，產(chǎn)生強烈地CTL應(yīng)答；說明該疫苗能夠通過免疫療法治療EB病毒相關(guān)的Hodgkin疾病和鼻咽癌。2012年，尉秀霞等[18]通過構(gòu)建包含去除癌基因的LMP1△DNA疫苗，并與攜帶LMP1△基因的重組腺病毒疫苗聯(lián)合接種；初步結(jié)果得到，單獨的LMP1△基因DNA疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生LMP1△特異性的CTL應(yīng)答；與攜帶LMP1基因的重組腺病毒疫苗聯(lián)合使用后，能夠提高特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。2009年，楊松梅等[19]聯(lián)合使用EB病毒LMP2的DNA疫苗、腺聯(lián)病毒疫苗和非復(fù)制5型腺病毒疫苗接種小鼠，該混合疫苗能夠有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對EB病毒相關(guān)鼻咽癌的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而為鼻咽癌的防治提供一種可行的疫苗策略。2012年，曾毅院士主導(dǎo)研發(fā)的重組LMP2腺病毒疫苗就鼻咽癌的治療進(jìn)入I期臨床試驗，以驗證該疫苗的安全性和生物活性。2008年，Elliott等[20]以EB病毒核抗原3（EBNA3）上的HLAB0801限制性多肽FLRGRAYGL為基礎(chǔ)，制備出可誘發(fā)特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的疫苗，并進(jìn)入I期臨床試驗；該疫苗旨在誘導(dǎo)針對EB病毒感染的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，并有效刺激機體產(chǎn)生抗EB病毒相關(guān)的惡性腫瘤；小量樣本臨床試驗結(jié)果也初步證明該疫苗能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生病毒特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。以單一病毒膜蛋白或核抗原為靶點的疫苗，在鼻咽癌的免疫治療方面已取得重要進(jìn)展；特別是我國自主研發(fā)治療鼻咽癌的重組LMP2疫苗已進(jìn)入臨床試驗，對我國進(jìn)行鼻咽癌的防治具有重大意義，因為全球80%的鼻咽癌患者在中國。

 

 

2010年，Lutzky等[21]在設(shè)計EB病毒疫苗時，為最大限度地提高機體的T細(xì)胞（包括CD4和CD8）識別EB病毒的幾率；利用重疊PCR技術(shù)將編碼EB病毒核抗原1（EBNA1）、LMP1和LMP2的基因合，然后插入到腺病毒載體中；使其在鼻咽癌的免疫治療中具有激活所有可能CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的潛能，從而盡可能地識別并殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療目的。2012年，Chia等[22]公布了在晚期轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者身上使用一種腺病毒誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞疫苗的II期臨床試驗結(jié)果，該腺病毒表達(dá)部分缺失的LMP1和全長LMP2，試驗結(jié)果證實該疫苗兼具安全性和有效性。Hui等[23]在2013年報道了在鼻咽癌患者使用重組改良的安卡拉痘苗（MVA-EL）的I期臨床試驗結(jié)果，該重組疫苗編碼EB病毒的EBNA1和LMP2，以刺激機體的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。試驗實施過程中將不同劑量的疫苗接種不同的病人，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該疫苗具有明顯地劑量效應(yīng)，即接種疫苗量最多的患者，具有更強地針對EBNA1和LMP2的細(xì)胞免疫應(yīng)答；并且兼具安全性和良好的免疫原性、生物活性，為II期臨床試驗驗證疫苗的臨床效果、有效性提供堅實地基礎(chǔ)。該疫苗已經(jīng)從2013年3月開始進(jìn)行為期三年的Ib期臨床試驗[24]，在更深入細(xì)致地研究疫苗安全性、免疫原性的同時，還將探討免疫系統(tǒng)是如何對該疫苗產(chǎn)生應(yīng)答、疫苗的副作用以及加強疫苗接種對免疫系統(tǒng)的效應(yīng)等。

 

 

2011年，德國的Ruiss等[25]制備出一種類病毒材料，其結(jié)構(gòu)與EB病毒類似，并以此獲得一株細(xì)胞系，這個細(xì)胞系包括有基因修飾的EB病毒基因組；但是缺失所有潛在的病毒癌基因，只含有供裝配、釋放等必須的病毒蛋白。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，這種基于EB病毒的材料具有很強地免疫原性，能有效刺激機體產(chǎn)生CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此這種類病毒材料不僅安全，也可以作為有效地EB病毒候選疫苗。這種以類病毒材料為載體，與前述EB病毒疫苗常用的腺病毒和痘苗病毒載體，兼具安全性和免疫原性，具體臨床試驗結(jié)果有待進(jìn)一步研究；但無疑為EB病毒疫苗的研究提供更廣地思路和途徑。2013年8月，H.Polansky和E.Itzkovitz[26]公布了一種抗多種病毒（包括EB病毒、人乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒和丙型肝炎病毒）藥物的上市后臨床試驗結(jié)果，藥物名為：Gene-Eden-VIR。該藥物包含有五種天然的物質(zhì)成分：槲皮黃銅、綠茶萃取物、肉桂萃取物、甘草萃取物和硒。根據(jù)對60位、年齡在20歲以上被感染個體的試驗結(jié)果表明，該藥物能夠安全、有效地進(jìn)行抗EB病毒、人乳頭瘤病毒等病毒感染。

 

3結(jié)論與展望

 

綜上所述，EB病毒疫苗的研制已經(jīng)取得令人可喜的結(jié)果，多種疫苗已進(jìn)入臨床試驗。然而，在疫苗的研究過程中依然存在一些困難：1）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展期，缺乏一個好的腫瘤標(biāo)志物[4，5]，使得后續(xù)的臨床試驗舉步維艱。2）在研究抗EB病毒感染和相關(guān)疾病時，缺乏相應(yīng)地動物模型。因為EB病毒具有很強的種屬特異性，且只感染人類。早在1985年，Epstein等[27]用gp350接種棉冠絨猴后，能夠保護(hù)其不患EB病毒誘導(dǎo)的B細(xì)胞淋巴瘤；但是棉冠絨猴為瀕危物種，使得這種動物模型的推廣大大受限。2012年，Zhang等[28]成功構(gòu)建出一種臨床前的小鼠動物模型，該小鼠能夠表達(dá)被B細(xì)胞特異性結(jié)合的改型EB病毒LMP1；實驗結(jié)果也揭示了LMP1在體內(nèi)被EB感染的B細(xì)胞的免疫監(jiān)視和轉(zhuǎn)化發(fā)揮重要角色，該模型也為B細(xì)胞淋巴瘤的治療提供新策略。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，病毒、疫苗及免疫佐劑等相關(guān)方面的研究不斷深入，為EB病毒相關(guān)疾病和腫瘤的治療提供了新的策略。Ogembo等[29]研究發(fā)現(xiàn)人補體受體1（即CD35）也可以做為EB病毒的受體，CD35在EB病毒的初次免疫中扮演重要的角色，為解釋病毒趨性及gp350/220作為EB病毒疫苗的重要性提供了良好的基礎(chǔ)。與此同時，科學(xué)家們也致力于佐劑的研究，和疫苗聯(lián)合作用，提高機體的抗腫瘤免疫。CpG寡脫氧核苷酸序列能夠通過Toll樣受體9（TLR9）激活機體的固有免疫，可以作為佐劑加強機體的抗感染和抗腫瘤免疫[30，31]。Zuo等[32]于2011報道一種新的靶向基因療法，用于治療EBV相關(guān)的鼻咽癌；該方法采用RNA干擾技術(shù)，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)其構(gòu)建的非病毒載體mc-oriP-IFNγ上的增強子oriP能夠特異性地與鼻咽癌細(xì)胞的EBNA1結(jié)合；從而使具有抑制腫瘤生長功能的IFNγ靶向到腫瘤部位發(fā)揮功能。在EB病毒疫苗的前期研究基礎(chǔ)之上，以及與不斷出現(xiàn)的最新研究成果和不同知識體系之間的相互借鑒、交融，對EB病毒的研究認(rèn)識更加清晰、透徹，也為EB病毒相關(guān)疾病和腫瘤的預(yù)防和治療，奠定了堅實的理論和實踐基礎(chǔ)。