H5亞型禽流感(如H5N1)是一種全世界范圍的人畜共患病，嚴重威脅著家禽產(chǎn)業(yè)以及人類的公共健康。對禽流感病毒進行及時、定量和亞型檢測，是快速診斷和疾病防控的重要基礎(chǔ)。等溫核酸擴增技術(shù)，尤其是環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，使核酸擴增可以在恒溫條件(60-65°C)下進行，是對傳統(tǒng)PCR技術(shù)的重要改進，尤其適用于條件欠發(fā)達地區(qū)以及現(xiàn)場快速檢測。數(shù)字等溫擴增技術(shù)，通過將反應(yīng)體系分隔為大小均一的大量反應(yīng)單元，進行獨立的單拷貝等溫擴增，并基于泊松分布，對起始模板數(shù)量進行精確統(tǒng)計，在準確性、靈敏度和絕對定量(不依賴于標準曲線)方面有了革命性的改進，尤其適用于病毒載量的定量檢測。因而，開發(fā)適用于禽流感檢測的數(shù)字LAMP技術(shù)具有重要意義。

 

杜文斌課題組最近研發(fā)了一種界面打印液滴生成方法(Cross-interfaceEmulsification,XiE)(Xuetal.,2016,Anal.Chem.88:3171-3177)。其原理是利用穩(wěn)定流速注射液體的毛細管在油-氣界面處的高頻振動，利用在油-氣界面的表面張力的周期性切割作用，實現(xiàn)均一液滴的制備。通過該方法，可快速連續(xù)生成大量皮升至納升體積微液滴，平鋪于96孔板容器底部形成液滴陣列。XiE技術(shù)不依賴于微加工技術(shù)，成本低、操作自動化程度高，非常適合于實現(xiàn)數(shù)字核酸擴增分析。前期的研究中，對基于XiE的數(shù)字等溫LAMP擴增進行了初步研究，表明這一系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)準確的核酸定量檢測。在前期工作的基礎(chǔ)上，與中科院動物研究所研究員何宏軒課題組合作，針對H5亞型的禽流感病毒的快速定量檢測，開展了模型驗證和禽流感真實樣品的檢測。建立了特異性的H5亞型禽流感病毒LAMP檢測引物探針，首次驗證了數(shù)字LAMP用于H5禽流感病毒檢測的特異性、靈敏度和線性范圍。研究結(jié)果表明，數(shù)字LAMP與實時熒光定量PCR，以及美國伯樂公司的QX200數(shù)字PCR系統(tǒng)的檢測靈敏度和線性一致，具有良好的特異性和準確性。值得指出的是，相比于數(shù)字PCR和熒光定量PCR，數(shù)字LAMP表現(xiàn)出更好的抗抑制劑能力(如腐植酸、SDS等)，可以保證方法對沒有充分除去污染物的野外或臨床樣品檢測的可靠性。

 

AbsoluteQuantificationofH5-subtypeAvianInfluenzavirusesUsingDropletDigitalLoop-mediatedIsothermalAmplification

 

ABSTRACT

 

HumaninfectionwithavianinfluenzaAH5N1virusescancauseseverediseaseswithhighmortalityrate,andcontinuestoposeasignificantthreattoglobalpublichealth.Rapiddiagnosisisneededforidentifyingthetypesofinfluenzavirusesformakingtimelytreatmentdecisions.Here,wedemonstrateabsolutequantificationofH5-subtypeinfluenzavirusesbydigitalloop-mediatedisothermalamplification(dLAMP)onourrecentlydevelopedcross-interfaceemulsification(XiE)method.OurresultsshowthatXiE-baseddLAMPishighlyspecificanddisplayscomparablesensitivitytoreal-timePCR(qPCR)anddigitalPCR(dPCR).Notably,dLAMPismoretoleranttoinhibitorysubstancesthanPCRmethods,anddemonstratesimilardetectionefficiencytoqPCRforrealH5N1samples.Therefore,itcanserveasarobustandprecisealternativetoqPCRordPCR,andisespeciallysuitableforenvironmentalandclinicalsampleswithhard-to-removecontaminants.WebelievethatourdLAMPmethodoffersgreatpotentialforrapidandaccuratediagnosisofinfluenzaandotherinfectiousdiseases.