權(quán)威發(fā)布：EV71疫苗質(zhì)量控制和評價技術(shù)要點

2018-07-24 來源：中國病毒學(xué)論壇標簽：掌上醫(yī)生喝茶減肥一天瘦一斤安全減肥 cps聯(lián)盟美容護膚

摘要：手足口?。℉and-foot-mouth disease, HFMD）是嬰幼兒人群常見的急性傳染病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱和手、足和口等部位的皮疹或皰疹，可并發(fā)無菌性腦膜炎、腦炎及急性弛緩性麻痹等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，甚至死亡。

為規(guī)范并提高我國EV71疫苗的質(zhì)控標準和生產(chǎn)一致性,保證上市疫苗安全、有效和質(zhì)量可控，日前中檢院正式發(fā)布EV71疫苗質(zhì)量控制和評價技術(shù)要點，現(xiàn)全文如下。

引言

手足口病（Hand-foot-mouthdisease,HFMD）是嬰幼兒人群常見的急性傳染病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱和手、足和口等部位的皮疹或皰疹，可并發(fā)無菌性腦膜炎、腦炎及急性弛緩性麻痹等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，甚至死亡。多種腸道病毒感染可引起HFMD，腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A組16型（CA16）為引起世界范圍內(nèi)HFMD爆發(fā)的主要病原體（1）。HFMD中約90%的死亡病例由EV71感染引起（2），EV71引起的HFMD已成為我國的重大公共衛(wèi)生問題之一。2015年，我國自主研發(fā)的EV71滅活疫苗獲批上市（3）。研究制定EV71疫苗質(zhì)量控制和評價技術(shù)技術(shù)要點，對規(guī)范并提高我國EV71疫苗的質(zhì)控標準和生產(chǎn)一致性，保證上市疫苗安全、有效和質(zhì)量可控具有重要意義。

本技術(shù)要點中EV71疫苗是指采用傳代細胞生產(chǎn)的全病毒滅活疫苗，或采用重組DNA技術(shù)將具有免疫保護性的抗原基因克隆到表達載體上，轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主中表達的EV71抗原蛋白，經(jīng)過純化等工藝制備的EV71疫苗。

本技術(shù)要點中凡涉及生物制品質(zhì)量控制的通用要求，均應(yīng)按現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》三部有關(guān)規(guī)定執(zhí)行（4）；有關(guān)生產(chǎn)設(shè)施的要求應(yīng)參照國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）2010版《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》執(zhí)行（5）。

本技術(shù)要點僅為對EV71疫苗進行質(zhì)控和評價技術(shù)要求的指導(dǎo)性文件，需根據(jù)技術(shù)的發(fā)展和實際需要進行適當?shù)母隆?/div>

一般考慮

EV71屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，為無包膜病毒。EV71顆粒為20面體的對稱結(jié)構(gòu)，直徑約24-30納米，由60個亞單位組成。病毒基因組為單股正鏈RNA，7400核苷酸左右，包含有5’-UTR區(qū)和3’-PolyA尾。

EV71的衣殼蛋白主要由VP1、VP2、VP3和VP4組成，其中，VP1、VP2和VP3位于病毒衣殼外部，VP4位于病毒衣殼內(nèi)部。VP1是EV71主要的抗原表位。EV71只有一個血清型，依據(jù)VP1區(qū)序列可分為A、B和C3個基因型以及11個基因亞型。我國臺灣、香港以及其他國家或地區(qū)近年來流行的主要基因型包括B4、B5、C2、C4和C5等亞型（6），我國大陸流行的EV71主要為C4亞型。5歲以下兒童和嬰幼兒為EV71易感人群（7）。在后脊髓灰質(zhì)炎時代，EV71已成為對人類健康危害最大的腸道病毒（8）。

多個國家或地區(qū)的企業(yè)和研究機構(gòu)開展了EV71疫苗的研發(fā)，疫苗種類包括全病毒滅活疫苗、基因工程重組蛋白疫苗、減毒活疫苗和多肽疫苗等（9）。其中，我國3家企業(yè)研發(fā)的EV71全病毒滅活疫苗對EV71感染所致HFMD的保護效果分別為97.4%，94.7%和90.0%（10-12）。2015年12月，CFDA批準中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所和北京科興生物制品有限公司生產(chǎn)的EV71全病毒滅活疫苗上市（3），為我國及世界范圍控制EV71感染相關(guān)的疾病，特別是嚴重HFMD的爆發(fā)和流行提供了手段。

近年來HFMD流行病原譜發(fā)生改變，柯薩奇病毒A組6型、A組10型病毒感染引起HFMD的流行呈增長趨勢，提出了研發(fā)防控HMFD多價疫苗的需（13,14）?；蚬こ讨亟M蛋白疫苗中的病毒樣顆粒（VLP）疫苗具有易工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢，且在動物試驗上顯示良好的保護效果，顯示了研發(fā)EV71VLP疫苗的可行性（15,16）。

本技術(shù)要點重點關(guān)注EV71疫苗生產(chǎn)的質(zhì)控和評價，強調(diào)生產(chǎn)過程的一致性，同時對研發(fā)階段的疫苗也提出相關(guān)標準和要求，以保證研發(fā)和生產(chǎn)階段中疫苗質(zhì)控和評價方法及標準的銜接。

1.臨床前質(zhì)控和評價

應(yīng)依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）相關(guān)文件以及CFDA《預(yù)防用疫苗臨床前研究技術(shù)技術(shù)要點》等技術(shù)文件進行EV71疫苗臨床前質(zhì)控和評價研究（17-19）。新研發(fā)疫苗的質(zhì)量標準整體上應(yīng)達到或高于上市疫苗的標準，動物保護試驗中疫苗免疫誘導(dǎo)的中和抗體水平和保護效果應(yīng)與上市疫苗具有可比性。

1.1滅活疫苗毒株和細胞基質(zhì)

疫苗生產(chǎn)用毒株的篩選和確定是滅活疫苗研發(fā)成功的關(guān)鍵。應(yīng)選擇主要流行基因型的毒株（目前我國為C4型）作為疫苗候選株進行篩選，重點關(guān)注不同毒株的交叉保護能力和遺傳穩(wěn)定性。采用目前世界范圍流行的毒株（B4、B5、C2、C4和C5等）及國內(nèi)不同地區(qū)的流行毒株，和/或構(gòu)建不同基因亞型的假病毒進行保護能力比較，選擇中和能力強且中和范圍廣的2~3個毒株作為EV71候選疫苗株。挑選主要免疫原性區(qū)域（VP1）核苷酸序列一致的毒株進行克隆純化，并規(guī)定代次，建立主種子批和工作種子批。進行擴大培養(yǎng)、發(fā)酵、收獲、純化及滅活工藝等適應(yīng)性研究，選擇工藝適應(yīng)性和免疫原性較好的候選疫苗株作為疫苗生產(chǎn)株。檢定項目應(yīng)包括鑒別試驗、病毒滴定、免疫原性、無菌檢查、外源因子和遺傳穩(wěn)定性等項，各級種子批VP1區(qū)核苷酸序列不應(yīng)發(fā)生改變，同時具有相近的病毒滴度和免疫原性。應(yīng)依據(jù)現(xiàn)行版《中國藥典》中的要求，建立符合規(guī)定的細胞庫用于生產(chǎn)。

1.2基因工程重組蛋白疫苗菌毒株和細胞庫

應(yīng)選擇EV71保護性抗原的基因序列作為目的基因，構(gòu)建基因工程重組蛋白疫苗的工程菌毒株（即生產(chǎn)用菌毒株）。目前，已報道應(yīng)用于研發(fā)EV71疫苗的表達系統(tǒng)包括釀酒酵母、漢遜酵母、畢赤酵母以及昆蟲細胞桿狀病毒等。構(gòu)建過程中應(yīng)篩選目的基因完全正確，表達量高且遺傳穩(wěn)定性好的克隆作為疫苗生產(chǎn)用菌毒株，建立三級種子系統(tǒng)。應(yīng)規(guī)定主種子批和工作種子批的代次，進行鑒別試驗、無菌檢查、遺傳穩(wěn)定性、抗原表達水平和免疫原性等項檢定。其中，漢遜酵母等表達體系應(yīng)測定整合拷貝數(shù)；釀酒酵母表達系統(tǒng)需測定質(zhì)粒保有率；表達產(chǎn)物應(yīng)鑒別為目的蛋白，建立表達量測定方法和標準。對昆蟲細胞，除應(yīng)符合常規(guī)傳代細胞系的要求外，還應(yīng)考慮對昆蟲細胞敏感的和可能引入的特殊污染病毒或外源因子（如螺原體），建立檢測方法和質(zhì)控指標。重組蛋白疫苗誘導(dǎo)的中和抗體與主要流行毒株和/或假毒株的中和交叉能力與滅活疫苗應(yīng)具有可比性。

1.3疫苗有效性評價

有研究提出EV71全病毒滅活疫苗免疫誘導(dǎo)的中和抗體水平可作為人體免疫保護的替代指標（10,11）。應(yīng)探討疫苗免疫不同品系動物后誘導(dǎo)的中和抗體應(yīng)答，確定適宜的動物模型，開展疫苗免疫原性驗證研究，獲得疫苗誘導(dǎo)的中和抗體應(yīng)答數(shù)據(jù)，包括1劑免疫后不同時間的抗體轉(zhuǎn)歸，2、3劑加強后的抗體應(yīng)答和轉(zhuǎn)歸，以及疫苗的劑量效應(yīng)關(guān)系。中和抗體測定常采用經(jīng)典的細胞病變法（CPE）或其他經(jīng)驗證的方法，假病毒方法可在經(jīng)過驗證及相關(guān)性分析后采用（20）。中和抗體水平可采用效價（Titer）表示，推薦采用國家標準品單位（U）或WHO單位（IU）作為中和抗體水平單位進行標化。免疫原性和保護效果評價可選擇乳鼠、小鼠及獼猴等作為模型動物。攻毒和免疫方式包括免疫母體后的母傳抗體攻毒保護法、抗體被動保護攻毒實驗動物法等。應(yīng)在先確定攻毒株的半數(shù)致死劑量（LD50）的基礎(chǔ)上，研究獲得疫苗動物保護的半數(shù)有效劑量（ED50）。可選用上市疫苗作為對照，也可比對報道的疫苗乳鼠保護ED50，綜合評定疫苗保護效果（21）。在進行評價時應(yīng)考慮方法的標準化和規(guī)范化，如標準毒株、標準物質(zhì)以及標準化的動物模型等。

1.4疫苗質(zhì)量特性研究和規(guī)程制定

應(yīng)依據(jù)現(xiàn)行版《中國藥典》三部中人用疫苗總論、基因重組產(chǎn)品總論以及相關(guān)技術(shù)要點等要求，結(jié)合自身生產(chǎn)工藝特點等，進行EV71疫苗質(zhì)量特性研究。內(nèi)容應(yīng)包括理化結(jié)構(gòu)確證、雜質(zhì)及純度分析、生物活性研究等。在進行全面質(zhì)量特性研究的基礎(chǔ)上建立疫苗的質(zhì)量標準。

EV71的中和表位主要包括3個區(qū)域，位于病毒的5次對稱軸附近：VP1的G-H環(huán)、H-I環(huán)和VP2的E-F環(huán)等（22）。對滅活疫苗，需重點關(guān)注與已上市疫苗結(jié)構(gòu)和活性的一致性，包括疫苗中實心（F）和空心（E）顆粒的比例、比活、誘導(dǎo)中和抗體能力以及動物保護效果等指標；對于基因重組VLP疫苗，應(yīng)對VLP蛋白結(jié)構(gòu)進行鑒別和分析，包括SDS-PAGE或N-末端測序等方法進行VLP分子量和構(gòu)成測定，采用特異的多抗或單克隆抗體鑒別VP1等抗原基因表達的目標蛋白，氨基酸序列分析、肽圖等方法鑒別VLP的一級結(jié)構(gòu)；采用原子力和透射電子顯微鏡，以及動態(tài)光散射等方法測定EV71VLP的聚集性；應(yīng)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)或免疫學(xué)手段分析VLP保護性結(jié)構(gòu)位點，研究不同條件下抗原結(jié)構(gòu)改變引起免疫原性的降低等。應(yīng)分析VLP疫苗與滅活疫苗中E顆粒結(jié)構(gòu)以及免疫原性的相似性，探討保護位點與滅活疫苗抗原的差異，比對相同蛋白含量或相同活性單位時免疫原性包括交叉保護能力的差異。

滅活疫苗標準應(yīng)不低于已上市疫苗，如主種子批和工作種子批VP1區(qū)核苷酸序列應(yīng)與原始種子一致，EV71抗原顆粒特異性峰按面積歸一化法計算純度（高效液相色譜法，HPLC）應(yīng)在95.0%以上，Vero細胞宿主蛋白和殘余DNA每劑不超過設(shè)定的標準等。EV71疫苗原液的F、E顆粒與疫苗免疫原性有關(guān)，Ｆ顆粒具有更好的免疫原性（23），研發(fā)滅活疫苗時建議考慮建立相應(yīng)的檢測方法，制定F及E顆粒比例的質(zhì)控標準。在工藝相關(guān)雜質(zhì)控制方面，當應(yīng)用DNA酶去除殘留宿主細胞DNA時，除應(yīng)關(guān)注殘留DNA酶的質(zhì)控外，應(yīng)考慮小片段DNA的生物學(xué)效應(yīng)及對免疫的影響，必要時應(yīng)研究相應(yīng)的檢測方法和標準（24）。

應(yīng)考慮建立VLP疫苗菌株或細胞表達目的蛋白的鑒別、表達量和遺傳穩(wěn)定性質(zhì)控標準。結(jié)構(gòu)鑒別是VLP疫苗質(zhì)控的重點，需在系統(tǒng)鑒別VLP抗原的基礎(chǔ)上，選擇確定科學(xué)、可行的結(jié)構(gòu)鑒別方法和標準，如定期N-末端測序方法等。建立并驗證檢測殘留菌株細胞蛋白、核酸成分、添加的有機溶劑、疫苗純度以及效力等指標的方法，并初步制定相應(yīng)的標準。應(yīng)探討國家EV71疫苗抗原含量和效力測定標準品是否適宜于所研發(fā)的制品，必要時應(yīng)建立相應(yīng)的參考品或?qū)φ掌?。此外，?yīng)參考已上市的重組類疫苗及重組類治療用生物制品的相關(guān)要求進行質(zhì)量控制。

疫苗研發(fā)時應(yīng)關(guān)注過程控制，在完成工藝優(yōu)化和驗證后，可將EV71疫苗抗原含量或比活作為一致性監(jiān)測的主要指標，收集不同批次檢測數(shù)據(jù)，擬定疫苗生產(chǎn)中關(guān)鍵質(zhì)控點的抗原含量或比活的一致性可接受范圍。

1.5標準物質(zhì)研究和應(yīng)用

疫苗質(zhì)量評價與標準物質(zhì)密不可分，只有采用統(tǒng)一的標示方式，不同國家或地區(qū)的疫苗管理、研發(fā)、生產(chǎn)及使用者在比較疫苗的關(guān)鍵質(zhì)量指標，如活性或效力時才能具有可比性。因此，在疫苗研發(fā)階段即應(yīng)重視建立及應(yīng)用疫苗標準物質(zhì)，以保證質(zhì)量的一致性和檢測結(jié)果的準確性。用于評價與臨床免疫保護效果相關(guān)的疫苗關(guān)鍵質(zhì)量屬性，如活性或效力測定時所用標準物質(zhì)，原則上應(yīng)來自可溯源至臨床試驗時具有確切保護效果的原料批次。企業(yè)應(yīng)采用已建立國家的EV71疫苗抗原標準品、中和抗體標準品、效力標準品進行疫苗的質(zhì)控和評價。在完成工藝優(yōu)化后，可考慮制備一批EV71疫苗抗原作為疫苗工作對照品，用于對其后研制批次疫苗的質(zhì)量比對。對企業(yè)自建的檢測方法，應(yīng)考慮建立相應(yīng)的工作參考品或?qū)φ掌贰?/div>

2.疫苗生產(chǎn)質(zhì)控和評價

2.1疫苗生產(chǎn)中質(zhì)控考慮要點

目前上市的EV71疫苗為純化、滅活的EV71全病毒抗原，經(jīng)氫氧化鋁佐劑吸附制備而成的疫苗。批準生產(chǎn)的細胞基質(zhì)分別為人二倍體細胞及Vero細胞。疫苗生產(chǎn)實施全過程質(zhì)量控制，要求對EV71疫苗生產(chǎn)過程的每一工藝環(huán)節(jié)，以及使用的每一種原輔材料進行質(zhì)控，并對關(guān)鍵步驟及其工藝參數(shù)建立控制范圍，建立關(guān)鍵中間產(chǎn)物質(zhì)控指標。依據(jù)WHO和我國對疫苗批簽發(fā)的相關(guān)要求，對EV71疫苗活性成分和雜質(zhì)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性定量檢測數(shù)據(jù)，以及疫苗質(zhì)控和檢測所使用的標準品、工作參考品及對照品均進行趨勢分析，以最大程度保證生產(chǎn)疫苗的批間一致性。在EV71疫苗成品效力檢定方面，設(shè)定了體內(nèi)效力和體外相對效力雙質(zhì)控標準，為將來用體外相對效力替代體內(nèi)效力提供基礎(chǔ)。

2.2疫苗標準物質(zhì)

目前已建立的國家疫苗標準物質(zhì)包括：EV71血清中和抗體國家標準品、EV71疫苗抗原國家標準品和EV71疫苗效力測定國家參考品。第一代EV71血清中和抗體國家標準品（2010國生標字0024），為健康人血清經(jīng)凍干分裝制備而成，包括強陽性（1000U）、弱陽性和陰性質(zhì)控品組成，用于疫苗誘導(dǎo)中和抗體測定的質(zhì)控。EV71疫苗抗原國家標準品（2010國生標字0023），為應(yīng)用Vero細胞基質(zhì)制備的EV71全病毒抗原（1600U/ml），用于疫苗抗原活性測定的質(zhì)控（25）。EV71疫苗效力測定國家參考品（2016國生參字0074），為應(yīng)用Vero細胞基質(zhì)制備的EV71全病毒滅活疫苗，經(jīng)III期疫苗臨床試驗獲得臨床保護效果的數(shù)據(jù)，同時具有較好的穩(wěn)定性，用于疫苗成品效力檢定的質(zhì)控（26）。

2015年，WHO生物制品標準化專家委員會批準第一代EV71血清中和抗體國際標準品（1stISforanti-EV71serum(Human)，批號：14/140），該標準品為健康人血清經(jīng)凍干分裝制備而成，每支含1000IU，用于EV71疫苗誘導(dǎo)中和抗體測定的質(zhì)控；以及低效價EV71國際參考品（批號：13/238），300IU/支，作為實驗質(zhì)控品（27）。目前EV71疫苗抗原國際標準品正在研制中。建議疫苗生產(chǎn)企業(yè)依據(jù)國家標準品建立用于產(chǎn)品放行質(zhì)控的參考品或?qū)φ掌罚瑧?yīng)注意標準物質(zhì)標定的可溯源性。

2.3生產(chǎn)用原材料

EV71疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用的種子批、細胞基質(zhì)，培養(yǎng)基/培養(yǎng)液等原材料的質(zhì)控標準應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求。應(yīng)使用批準的工作種子批代次生產(chǎn)疫苗。主種子批和工作種子批應(yīng)測定病毒滴度，疫苗株的主要保護蛋白VP1區(qū)核苷酸序列在不同種子批之間應(yīng)不發(fā)生改變，以保證遺傳穩(wěn)定性，免疫原性檢測標準為應(yīng)用１針程序免疫小鼠，中和抗體陽轉(zhuǎn)率應(yīng)大于80%。應(yīng)進行無菌檢查、支原體檢查和外源因子檢查，保證無細菌、真菌、支原體及外源因子污染。

只有經(jīng)批準的細胞基質(zhì)才能用于EV71疫苗生產(chǎn)，疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用的細胞基質(zhì)包括已批準的二倍體和Vero細胞。WHO建議疫苗生產(chǎn)企業(yè)盡可能采用150代作為Vero細胞的限定代次（28）。主細胞庫至少需進行反轉(zhuǎn)錄病毒實驗、牛源或豬源病毒檢查、致瘤性試驗、無菌檢查、支原體檢查和外源因子檢查等，同時應(yīng)對細胞培養(yǎng)用牛血清的來源進行限定。

2.4病毒接種、培養(yǎng)和收獲

取EV71疫苗工作種子批毒種，按規(guī)定的MOI接種細胞基質(zhì)，依據(jù)批準的溫度、時間培養(yǎng)病毒并收獲。單個收獲物的儲存應(yīng)在批準的條件和時限內(nèi)。同一細胞批生產(chǎn)的病毒液合并為病毒收獲液。病毒收獲液應(yīng)按照連續(xù)生產(chǎn)過程進入后續(xù)的純化處理工藝。樣品收獲后應(yīng)立刻進行抽樣檢定。

2.5收獲物檢定

收獲物的關(guān)鍵檢定項目包含病毒滴定、抗原含量和蛋白含量測定，以及無菌檢查和支原體檢查等項，應(yīng)分別符合批準的標準。生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)提供收獲次數(shù)中單個生產(chǎn)收獲物，以及合并收獲物的各自一致性檢測數(shù)據(jù)，并應(yīng)符合已批準的體現(xiàn)質(zhì)量一致性的標準。

2.6純化工藝

應(yīng)采用批準的工藝進行EV71疫苗抗原的純化，如色譜柱層析等。純化的病毒液可進行合并和適當濃縮。純化病毒液經(jīng)濾膜過濾即為疫苗原液。當EV71疫苗原液因等待檢測結(jié)果需暫存時，應(yīng)依據(jù)前期穩(wěn)定性研究的結(jié)果，按批準的保存方式和時間保存。

2.7病毒滅活及驗證

應(yīng)采用批準的經(jīng)驗證的滅活劑和工藝進行EV71病毒的滅活，在限定總蛋白含量下，采用一定濃度的滅活劑，在確定的最佳溫度下滅活足夠時間，保證EV71病毒得到充分滅活。對每個病毒滅活容器均取樣進行病毒滅活驗證試驗，按規(guī)定量，將EV71滅活液接種適宜細胞基質(zhì)，35～37℃培養(yǎng)5～7天，凍融后同法再盲傳２代，顯微鏡觀察每代次應(yīng)均無CPE。

2.8原液檢定

應(yīng)采用批準的EV71鑒別實驗、抗原含量等檢測方法對原液和中間產(chǎn)物進行質(zhì)控。抗原含量的檢測多采用ELISA方法，需應(yīng)用國家抗原標準品進行質(zhì)控和含量賦值（U），也可自建對照品以監(jiān)測測定結(jié)果的準確性。由于EV71疫苗為鋁佐劑吸附疫苗，在成品中受佐劑以及蛋白稀釋等因素影響的檢定項目需在原液階段進行。疫苗相關(guān)工藝雜質(zhì)如牛血清白蛋白殘留量、Vero細胞蛋白殘留量和DNA殘留量，殘留添加物如有機溶劑聚乙二醇6000、聚山梨酯80或Triton-X100等，以及非限制性核酸內(nèi)切酶限度檢定均應(yīng)符合批準的限度。疫苗抗原純度檢測時原液中目標蛋白的純度應(yīng)不低于95.0%。應(yīng)采用適宜的方法測定原液中可能潛在雜質(zhì)蛋白的含量或比例，如SDS-PAGE或HPLC方法等。應(yīng)關(guān)注抗原降解產(chǎn)物的鑒別和檢測，考慮制定可接受的范圍。病毒滅活驗證試驗時，將細胞盲傳3代，應(yīng)不得出現(xiàn)細胞病變。應(yīng)證明無細菌、真菌、分枝桿菌和支原體污染。

2.9半成品配制和檢定

依據(jù)每批疫苗按抗原定量配制的要求，基于原液中EV71抗原的測定含量，以及成品疫苗的目標劑量，加入稀釋液及氫氧化鋁吸附劑，配制成目標劑量的半成品。由于EV71疫苗為鋁佐劑吸附產(chǎn)品，半成品檢定時除檢測無菌、pH和氫氧化鋁外，應(yīng)測定EV71抗原吸附率。

2.10成品分裝和檢定

依據(jù)企業(yè)注冊標準和現(xiàn)行版《中國藥典》進行分裝、包裝和檢定。自建的方法需經(jīng)批準，應(yīng)用藥典的方法需經(jīng)過驗證。疫苗成品質(zhì)控項目包括EV71疫苗鑒別實驗、外觀、裝量、無菌檢查、細菌內(nèi)毒素檢查和異常毒性等指標；理化項目包括pH，氫氧化鋁含量，游離甲醛含量以及滲透壓摩爾濃度等指標。細胞培養(yǎng)液中添加抗生素時，需檢測成品中抗生素殘留量。疫苗的效力測定包括體內(nèi)效力（ED50）以及體外相對效力，并測定中和抗體應(yīng)答。疫苗抗原含量和中和抗體水平測定時需應(yīng)用國家抗原和中和抗體標準品進行質(zhì)控和賦值。抗原含量或效力測定標準的確定應(yīng)綜合考慮檢測方法的誤差，半成品配制操作過程中可能存在的偏差，以及成品在有效期內(nèi)可接受的抗原降解。

2.11穩(wěn)定性評價、儲存和有效期

EV71疫苗為鋁佐劑吸附疫苗，具有較好的穩(wěn)定性。疫苗穩(wěn)定性評價應(yīng)依據(jù)WHO相關(guān)文件和現(xiàn)行版《中國藥典》中人用疫苗總論等要求進行（4,29）。穩(wěn)定性評價的類型包括實時條件下、加速穩(wěn)定性、極端條件下及熱穩(wěn)定性研究，其中實時條件下穩(wěn)定性研究為最基本的研究，疫苗獲批后生產(chǎn)階段一般選擇在實時條件下的穩(wěn)定性研究。按照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（2010年修訂）中持續(xù)穩(wěn)定性考察要求進行。通常情況下至少每年應(yīng)當考察一個批次。中間產(chǎn)物穩(wěn)定性評價目的為確定中間產(chǎn)物儲存的條件和時間。成品穩(wěn)定性評價則是確定疫苗的保持條件和有效期，并保證有效期內(nèi)疫苗的有效性和安全性。EV71疫苗中間產(chǎn)物和疫苗成品的儲存條件和時間應(yīng)依據(jù)批準的標準執(zhí)行。EV71疫苗為鋁佐劑吸附疫苗，嚴禁凍結(jié)，因鋁佐劑疫苗遭凍結(jié)后將永久性破壞免疫原性。

3.疫苗批簽發(fā)

疫苗批簽發(fā)，是指國家食品藥品監(jiān)管部門對預(yù)防性疫苗在每批制品出廠上市前或者進口時，由指定的藥品檢驗機構(gòu)進行審核、檢驗及簽發(fā)的制度（30）。我國疫苗批簽發(fā)主要采用資料審核和樣品檢驗相結(jié)合的形式。在批簽發(fā)過程中，應(yīng)特別重視對關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)的趨勢分析。應(yīng)用趨勢分析可發(fā)現(xiàn)某些批次疫苗出現(xiàn)偏差，啟動調(diào)查并采取措施；考察生產(chǎn)過程中發(fā)生的變更對制品的影響（如工作種子批、設(shè)備）以及在一定生產(chǎn)周期內(nèi)疫苗質(zhì)量的變化趨勢。因此疫苗批簽發(fā)是確定疫苗生產(chǎn)一致性，保證上市疫苗有效性、安全性的必要手段。

3.1EV71疫苗批制造及檢定記錄摘要應(yīng)包括的主要內(nèi)容及關(guān)鍵參數(shù)

企業(yè)應(yīng)向批簽發(fā)藥檢機構(gòu)提供每批EV71疫苗的批制造及檢定記錄摘要。批制造及檢定記錄摘要應(yīng)涵蓋生產(chǎn)、檢定過程中各環(huán)節(jié)的主要參數(shù)、經(jīng)批準的企業(yè)名稱、地址，及所生產(chǎn)疫苗的品種、批量和批號等，所提供的信息應(yīng)確定、并可追溯。注明成品中起始材料、中間產(chǎn)物及半成品各個組分的失效日期；以生產(chǎn)流程圖的方式，確認疫苗起始材料、中間產(chǎn)物、半成品和成品的唯一、合理的生產(chǎn)流程，生產(chǎn)流程應(yīng)能追溯主要組分生產(chǎn)全過程；疫苗生產(chǎn)用毒株、二倍體細胞或Vero細胞基質(zhì)的名稱和代次應(yīng)與批準的一致；證實疫苗生產(chǎn)工藝及規(guī)模、質(zhì)控檢測方法、質(zhì)量標準，中間產(chǎn)物的批號、批量、保存條件等數(shù)據(jù)與批準的相同。關(guān)鍵工藝步驟操作參數(shù)、關(guān)鍵中間產(chǎn)物檢測結(jié)果、目的產(chǎn)物收率應(yīng)在可接受范圍內(nèi)；依據(jù)所提供的相關(guān)信息確認疫苗中活性組分含量等的理論值和實際值；提供疫苗起始材料、中間產(chǎn)物、半成品和成品的檢測結(jié)果和質(zhì)量標準，包括每項檢定的結(jié)果；應(yīng)提供檢測的起始日期、方法、關(guān)鍵試劑，標準物質(zhì)、工作參考品和對照品的列表以及相關(guān)的制備、標定和穩(wěn)定性等關(guān)鍵信息。

3.2EV71疫苗批簽發(fā)趨勢分析的技術(shù)要求

對EV71疫苗關(guān)鍵中間產(chǎn)物及成品活性成分和雜質(zhì)的定量檢測數(shù)據(jù)，均應(yīng)進行趨勢分析，如收獲液病毒滴度，原液抗原含量、蛋白含量、純度，成品體外相對效力、體內(nèi)效力、理化指標以及可定量檢測的雜質(zhì)等項目；對于疫苗質(zhì)控和檢測中所使用的標準物質(zhì)、工作參考品及對照品也應(yīng)進行趨勢分析。

生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)對EV71疫苗檢驗的所有關(guān)鍵性定量數(shù)據(jù)繪制趨勢分析圖。當疫苗檢測批次結(jié)果的數(shù)量少于40個，應(yīng)在至少6個連續(xù)批檢驗結(jié)果的基礎(chǔ)上計算平均值和SD值，每個新的結(jié)果可添加并重新計算平均值和SD值。當批次結(jié)果數(shù)量等于或多于40個時，應(yīng)根據(jù)至少10批不同原液得到最初的40個結(jié)果確定平均值和SD值。在其后持續(xù)進行趨勢分析中不再隨新增檢驗結(jié)果重新計算平均值，避免因引入新的檢測數(shù)據(jù)而發(fā)生偏移。

生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)確定疫苗質(zhì)控關(guān)鍵項目趨勢分析的警戒限和行動限。當出現(xiàn)1批疫苗檢驗結(jié)果超出行動限，3個連續(xù)批疫苗超出警戒限，或趨勢有嚴重漂移，以及連續(xù)3至5批疫苗在均值一側(cè)且接近警戒限時，應(yīng)啟動調(diào)查，查找分析原因，評估對疫苗質(zhì)量的影響風險，確定相關(guān)批次疫苗是否予以放行，批簽發(fā)機構(gòu)依據(jù)同樣的原則決定是否予以簽發(fā)。

應(yīng)開展標準物質(zhì)和對照品的趨勢分析，目的是為監(jiān)測EV71疫苗標準物質(zhì)的活性，以進行檢定實驗室的質(zhì)控。包括對應(yīng)用國家標準物質(zhì)的測定值，以及對企業(yè)用于疫苗質(zhì)控和檢測所自建工作參考品、對照品測定值的趨勢分析等，應(yīng)繪制趨勢分析圖，規(guī)定相應(yīng)的警戒限和行動限。

應(yīng)定期完成疫苗趨勢分析和報告。EV71疫苗生產(chǎn)企業(yè)和批簽發(fā)機構(gòu)分別每半年或一年將各自檢測關(guān)鍵項目的數(shù)據(jù)與前期數(shù)據(jù)進行比較。需比較批簽發(fā)機構(gòu)與生產(chǎn)企業(yè)的數(shù)據(jù)，結(jié)果分析時應(yīng)考慮兩者檢定時的時間差異。

4.起草單位和致謝

起草單位：中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所肝炎病毒疫苗室

致謝：提出修改意見的各位專家及3家EV71疫苗生產(chǎn)企業(yè)

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