中國科學(xué)院武漢病毒研究所龔鵬研究員課題組長期從事以聚合酶為核心的RNA病毒復(fù)制關(guān)鍵酶類的催化與調(diào)控機(jī)制研究，2013年10月起與武漢大學(xué)潘茲書教授課題組建立合作關(guān)系，共同研究黃病毒科瘟病毒屬代表種豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）的NS5B聚合酶與NS3蛋白酶-解旋酶的功能機(jī)制。2015年和2017年，豬瘟病毒NS3解旋酶和全長晶體結(jié)構(gòu)先后報道，但結(jié)構(gòu)中并未發(fā)現(xiàn)蛋白酶與解旋酶形成的分子內(nèi)關(guān)鍵相互作用。近期，該合作團(tuán)隊解析了一種新的“關(guān)閉式”構(gòu)象的NS3全長晶體結(jié)構(gòu)（PDB號：5WX1），結(jié)構(gòu)中蛋白酶與解旋酶形成了由三個相互作用簇構(gòu)成的面積達(dá)2200平方埃的分子內(nèi)作用界面，首次發(fā)現(xiàn)了瘟病毒NS3可采取一種和蛋白酶順式切割相關(guān)的構(gòu)象（圖中上方構(gòu)象），明確與反式切割（圖中下方構(gòu)象）不兼容。團(tuán)隊對此關(guān)閉式構(gòu)象的生物學(xué)相關(guān)性進(jìn)行了體外酶學(xué)驗證，發(fā)現(xiàn)這一構(gòu)象具有最優(yōu)的解旋酶活性，通過點突變擾動該構(gòu)象可導(dǎo)致解旋酶活性大幅降低。進(jìn)一步通過在全長病毒水平的測試發(fā)現(xiàn)對上述三個相互作用簇的擾動均可不同程度地影響病毒滴度和病毒噬斑形成及尺寸，驗證了晶體結(jié)構(gòu)所揭示的關(guān)閉式構(gòu)象對病毒復(fù)制的重要性。

 

豬瘟病毒NS3蛋白酶-解旋酶協(xié)同作用模式圖。上方的關(guān)閉式構(gòu)象為本項研究解析的晶體結(jié)構(gòu)所揭示，模擬蛋白酶（Pro）順式切割NS3-NS4A連接點后的狀態(tài)，具有最優(yōu)的解旋酶（Hel）活性。該構(gòu)象需轉(zhuǎn)換為開放式構(gòu)象（下方）后方可實現(xiàn)反式切割，但解旋酶活性隨之降低。

 

黃病毒科NS3不僅自身具有功能多樣性，還直接參與調(diào)控病毒聚合酶的功能，團(tuán)隊的研究成果不僅為全面闡釋NS3的功能提供了重要依據(jù)，也為進(jìn)一步研究NS3與NS5B聚合酶的分子間調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。此項合作研究受到科技部973項目“重要病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)功能研究”（2013CB911100）和數(shù)項國家自然科學(xué)基金面上項目（31272585、31570152、31670154）的支持。潘茲書課題組的博士研究生鄭峰偉和龔鵬課題組的助理研究員逯國亮為論文的并列第一作者。

 

ABSTRACT

 

ThenonstructuralproteinNS3fromtheFlaviviridaefamilyisamulti-functionalproteinthatcontainsanN-terminalproteaseandaC-terminalhelicase,playingessentialrolesinviralpolyproteinprocessingandgenomereplication.Herewereportafull-lengthcrystalstructureoftheClassicalswinefevervirus(CSFV)NS3incomplexwithitsNS4Aproteasecofactorsegment(PCS)at2.35?resolution.Thestructurerevealsapreviouslyunidentified～2200-?2intra-molecularprotease-helicaseinterfacecomprisingthreeclustersofinteractions,representinga“closed”globalconformationrelatedtotheNS3-NS4Acis-cleavageevent.Althoughthisconformationisincompatiblewithproteasetrans-cleavage,itappearstobefunctionallyimportantandbeneficialtothehelicaseactivity,asthemutationsdesignedtoperturbthisconformationimpairedboththehelicaseactivitiesinvitroandvirusproductioninvivo.Collectively,ourworkrevealsimportantfeaturesofprotease-helicasecoordinationinpestivirusNS3,andprovidesakeybasisforhowdifferentconformationalstatesmayexplicitlycontributetocertainfunctionsofthisnaturalprotease-helicasefusionprotein.

 

IMPORTANCE

 

ManyRNAvirusesencodehelicasestoaidtheirRNAgenomereplicationandtranscriptionbyunwindingstructuredRNA.Beingnaturallyfusedtoaproteaseparticipatinginviralpolyproteinprocessing,theNS3helicasesencodedbytheFlaviviridaefamilyvirusesarequiteunique.Therefore,howthesetwoenzymemodulescoordinateinasinglepolypeptideisofparticularinterest.HerewereportapreviouslyunidentifiedconformationofpestivirusNS3incomplexwithitsNS4Aproteasecofactorsegment(PCS).Thisconformationalstateisrelatedtotheproteasecis-cleavageeventandisoptimalforthefunctionofhelicase.ThisworkprovidesanimportantbasistounderstandhowdifferentenzymaticactivitiesofNS3maybeachievedbythecoordinationbetweentheproteaseandhelicasethroughdifferentconformationalstates.