桿狀病毒是專一性感染節(jié)肢動物的病毒，其基因組為大型環(huán)狀雙鏈DNA，核衣殼呈桿狀，外有囊膜包裹。苜蓿丫蚊夜蛾核多角體病毒（Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是桿狀病毒的代表種。桿狀病毒的基因組復(fù)制和核衣殼裝配均在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中完成。成熟的核衣殼運出細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)膜處出芽，形成芽生型病毒粒子（buddedvirion，BV）；或者滯留在細(xì)胞核內(nèi)，被病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的核內(nèi)微囊泡包裹，形成包埋型病毒粒子（occlusion-derivedvirion，ODV）。已有的研究表明，核衣殼主要通過從核膜出芽進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而核內(nèi)微囊泡則是由核膜向核質(zhì)方向出芽而成。因此，兩種病毒粒子的形態(tài)發(fā)生都包括核膜出芽這一過程，但具體的機(jī)制尚不清楚。

 

AcMNPV的ac75基因在桿狀病毒中高度保守，除了侵染蚊子的桿狀病毒外，其他已測定全基因組序列的桿狀病毒中均存在ac75的同源基因，但其在桿狀病毒生活周期中的功能未知。研究人員構(gòu)建了ac75基因缺失型重組病毒以及融合標(biāo)簽蛋白編碼序列的補回型重組病毒，研究該基因的缺失對病毒復(fù)制的影響。研究結(jié)果顯示缺失了ac75基因后，核衣殼滯留在細(xì)胞核內(nèi)無法出核，核內(nèi)微囊泡也無法形成，從而導(dǎo)致BV和ODV的產(chǎn)生均被阻斷。

 

ac75的缺失影響了病毒核衣殼的出核和核內(nèi)微囊泡的形成，從而導(dǎo)致BV和ODV均不能產(chǎn)生

 

研究人員進(jìn)一步檢測了Ac75蛋白的表達(dá)特征、定位及其與其他病毒蛋白的互作，發(fā)現(xiàn)ac75是晚期基因，可表達(dá)分子量不同（18kDa和15kDa）的兩種蛋白產(chǎn)物。有趣的是，18kDa的蛋白分布在BV的核衣殼和囊膜上，而15kDa的蛋白僅分布在BV和ODV的核衣殼上。免疫熒光分析結(jié)果顯示Ac75在感染早期沿細(xì)胞核膜呈環(huán)狀分布，在感染后期則主要分布于核內(nèi)環(huán)帶區(qū)。然而，相分離實驗表明，Ac75不是整合膜蛋白，但其可與目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個同樣影響核內(nèi)微囊泡產(chǎn)生的整合膜蛋白Ac76在細(xì)胞質(zhì)、核膜和核內(nèi)環(huán)帶區(qū)發(fā)生相互作用，暗示Ac75可能是通過與整合膜蛋白Ac76的相互作用結(jié)合到核膜上，并影響核膜的功能。

 

Ac75與Ac76在在細(xì)胞質(zhì)、核膜和核內(nèi)環(huán)帶區(qū)發(fā)生相互作用

 

繼ac93之后，本研究鑒定了第二個同時影響核衣殼出核和核內(nèi)微囊泡產(chǎn)生的桿狀病毒基因——ac75。該基因的功能鑒定和深入研究有助于揭示核衣殼出核和核內(nèi)微囊泡產(chǎn)生的共同步驟的分子機(jī)制，進(jìn)而促進(jìn)我們對桿狀病毒兩種病毒粒子形態(tài)發(fā)生機(jī)制的理解。

 

中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院袁美妗副教授為論文的通訊作者，石安琪博士研究生和胡朝陽博士為論文的并列第一作者。本研究由國家自然科學(xué)基金面上項目和廣州市科技計劃項目資助完成。

 

ABSTRACT

 

Autographacalifornicanucleopolyhedrovirus(AcMNPV)orf75(ac75)isahighlyconservedgeneofunknownfunction.Inthisstudy,weconstructedanac75knockoutAcMNPVbacmidandinvestigatedtheroleofac75inthebaculoviruslifecycle.TheexpressionanddistributionoftheAc75proteinwerecharacterized,anditsinteractionwithanotherviralproteinwasanalyzedtofurtherunderstanditsfunction.Ourdataindicatedthatac75wasrequiredforthenuclearegressofnucleocapsids,intranuclearmicrovesicleformation,andsubsequentbuddedvirion(BV)formation,aswellasocclusion-derivedvirion(ODV)envelopmentandembeddingofODVsintopolyhedra.Westernblotanalysesshowedthattwoformsof18and15kDaofFLAG-taggedAc75proteinweredetected.Ac75wasassociatedwithbothnucleocapsidandenvelopefractionsofBV,butonlythenucleocapsidfractionofODV;the18-kDaformwasassociatedwithonlyBVs,whereasthe15-kDaformwasassociatedwithbothtypesofvirion.Ac75waspredominantlylocalizedintheintranuclearringzoneduringinfectionandexhibitedanuclearrimdistributionduringtheearlyphaseofinfection.Aphase-separationassaysuggestedthatAc75wasnotanintegralmembraneprotein.AcoimmunoprecipitationassayrevealedaninteractionbetweenAc75andtheintegralmembraneproteinAc76,andbimolecularfluorescencecomplementationassaysidentifiedthesitesoftheinteractionwithinthecytoplasm,atthenuclearmembraneandringzoneinAcMNPV-infectedcells.Ourresultshaveidentifiedac75asasecondgenethatisrequiredforboththenuclearegressofnucleocapsidsandtheformationofintranuclearmicrovesicles.

 

IMPORTANCE

 

Duringthebaculoviruslifecycle,themorphogenesisofbothbuddedvirions(BVs)andocclusion-derivedvirions(ODVs)isproposedtoinvolveabuddingprocessatthenuclearmembrane,whichoccurswhilenucleocapsidsegressfromthenucleusorwhenintranuclearmicrovesiclesareproduced.However,theexactmechanismofvirionmorphogenesisremainsunknown.Inthisstudy,weidentifiedac75asasecondgene,inadditiontoac93,thatisessentialforthenuclearegressofnucleocapsids,intranuclearmicrovesicleformation,andsubsequentBVformation,aswellasODVenvelopmentandembeddingofODVsintopolyhedra.Ac75isnotanintegralmembraneprotein.However,itinteractswithanintegralmembraneprotein(Ac76)andisassociatedwiththenuclearmembrane.Thesedataenhanceourunderstandingofthecommonalitiesbetweennuclearegressofnucleocapsidsandintranuclearmicrovesicleformationandmayhelptorevealinsightsintothemechanismofbaculovirusvirionmorphogenesis.