桂芍鎮(zhèn)癇片主要成份有桂枝、白芍、黨參、半夏(制)、柴胡、黃芩、甘草、生姜、大棗。那么，桂芍鎮(zhèn)癇片的含量怎么測(cè)定呢？

原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有黃芩、白芍的鑒別,無(wú)含量測(cè)定。為了好地控制本品質(zhì)量,本試驗(yàn)對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究。采用薄層色譜(TLC)法對(duì)制劑中的甘草、黨參及柴胡進(jìn)行了鑒別,采用液相色譜(HPLC)法對(duì)制劑中君藥白芍的主要成分芍藥苷進(jìn)行了含量測(cè)定。

1儀器與試藥

LC-20AT液相色譜儀,包括SPD-20A檢測(cè)器、Labsolution色譜數(shù)據(jù)處理工作站(日本島津)；賽多利斯電子天平(1/100000,德國(guó))；KQ-250DE數(shù)控型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

甘草次酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110723-200411)；黨參對(duì)照藥材(供鑒別用,中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)121057-200303)；柴胡對(duì)照藥材(供鑒別用,中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)120992-0301)；芍藥苷對(duì)照品(供含量測(cè)定用,中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110736-200423)；桂芍鎮(zhèn)癇片樣品(自制,批號(hào)060811、060812、060813)。乙腈為色譜純,水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

2定性鑒別

2.1甘草的鑒別

取本品10片,除去薄膜衣,研細(xì),稱(chēng)取細(xì)粉3g,加氯仿40mL,回流提取30min,濾過(guò),濾渣揮干溶劑,加甲醇40mL,回流提取1h,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)铀?0mL使溶解,用水飽和的正丁醇提取3次,每次20mL,合并正丁醇液,用正丁醇飽和的水洗滌2次,每次20mL,合并正丁醇液,蒸干,殘?jiān)蛹状?mL使溶解,作為供試品溶液。另取甘草次酸對(duì)照品,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版(一部)附錄ⅥB]試驗(yàn),吸取供試品溶液5～10μL、對(duì)照品溶液4μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(30～60℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(10∶20∶7∶0.5)為展開(kāi)劑[1],展開(kāi),取出,晾干,噴以10%磷鉬酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2黨參的鑒別

取本品10片,除去薄膜衣,研細(xì),稱(chēng)取細(xì)粉3g,加正丁醇50mL,超聲處理30min,濾過(guò),濾液濃縮至約0.5mL,作為供試品溶液。另取黨參對(duì)照藥材2g,加水20mL,微沸煮40min,濾過(guò),濾液用正丁醇30mL振搖提取,正丁醇液濃縮至1mL,作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版(一部)附錄ⅥB]試驗(yàn),吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以正丁醇-無(wú)水乙醇-水(15∶3∶2)為展開(kāi)劑[2],展開(kāi),取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇,于105℃下加熱。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.3柴胡的鑒別

取本品10片,除去薄膜衣,研細(xì),稱(chēng)取細(xì)粉3g,置具塞錐形瓶中,加甲醇50mL,超聲處理30min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)铀?0mL使溶解,并轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,用水飽和的正丁醇提取3次,每次40mL,合并正丁醇液,用氨試液40mL洗滌,棄去氨液,正丁醇層蒸干,殘?jiān)蛹状?mL使溶解,作為供試品溶液。取柴胡對(duì)照藥材1g,加水微沸30min,濾過(guò),濾液濃縮至約30mL,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,余項(xiàng)操作同供試品,即得對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版(一部)附錄ⅥB]試驗(yàn),吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各10μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)為展開(kāi)劑[3],展開(kāi),取出,晾干,噴以10%磷鉬酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。

3含量測(cè)定

3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱為DiamonsilTMC18(5μm,200mm×4.6mm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸溶液(15∶85),流速為1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm；柱溫為室溫。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000；分離度R＞1.5。

3.2溶液的制備

3.2.1對(duì)照品溶液

精密稱(chēng)取芍藥苷對(duì)照品12.26mg,置100mL量瓶中,加甲醇適量使溶解,定容,搖勻,精密量取5.0mL,置10mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò),即得。

3.2.2供試品溶液

取桂芍鎮(zhèn)癇片10片,除去薄膜衣,研細(xì),取細(xì)粉0.2g,精密稱(chēng)定,置50mL量瓶中,加稀乙醇35mL,超聲處理((功率250W,頻率40kHz),放冷,加稀乙醇定容,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò),即得。

3.2.3陰性對(duì)照品溶液

按處方組成及制備工藝制備不含芍藥的樣品,按“3.2.2”項(xiàng)下方法處理,即得。

3.3空白干擾試驗(yàn)

按上述色譜條件,分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液,注入液相色譜儀,測(cè)定。結(jié)果在供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰,而陰性對(duì)照品溶液在此無(wú)峰,見(jiàn)圖1。芍藥苷與其他組分分離良好,說(shuō)明陰性樣品對(duì)芍藥苷含量測(cè)定無(wú)干擾。

3.4線(xiàn)性范圍考察

精密吸取對(duì)照品溶液4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μL,按上述色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖,以峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),進(jìn)行線(xiàn)性回歸,得回歸方程為：Y＝1547954X＋14289(r＝0.9997)。結(jié)果表明,芍藥苷在0.2452～0.7356μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

3.5精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10μL,按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次,記錄色譜圖,計(jì)算。結(jié)果RSD＝0.81%,表明本法精密度較好。

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10μL,按上述色譜條件測(cè)定,分別于0、4、8、12、24h進(jìn)樣,記錄色譜圖,測(cè)定峰面積,計(jì)算。結(jié)果RSD＝1.04%,表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.7重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)060811)5份,按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖,測(cè)定峰面積,計(jì)算。結(jié)果本品平均含量為13.06mg/g(RSD＝1.10%),表明本方法重復(fù)性良好。

3.8加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品(批號(hào)060811,含量13.06mg/g),除去薄膜衣,研細(xì),取0.1g,精密稱(chēng)定,置50mL量瓶中,精密加入芍藥苷對(duì)照品溶液10mL(濃度為0.1226mg/mL),其余按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖,計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)表1。本方法回收率在96.7%～100.3%之間,RSD＝1.52%,表明方法的準(zhǔn)確性較好。

3.9樣品測(cè)定

取3個(gè)批號(hào)(060811、060812、060813)的樣品,平行2份,按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密量取對(duì)照品、供試品溶液各10μL,按上述色譜條件測(cè)定,測(cè)定峰面積,計(jì)算。結(jié)果3個(gè)批號(hào)樣品中芍藥苷的平均含量分別為4.12、4.09、4.08mg/片。

4討論

曾試驗(yàn)了甲醇-0.1%磷酸溶液(35∶65)、甲醇-水(30∶70)及乙腈-0.1%醋酸溶液(25∶75)等流動(dòng)相系統(tǒng),結(jié)果均不理想。而流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸溶液(15∶85)時(shí),具有較好的分離度和適宜的保留時(shí)間,故以此作為含量測(cè)定的流動(dòng)相。

在篩選樣品中芍藥苷的提取條件時(shí),比較了稀乙醇加熱回流法和超聲提取法,結(jié)果超聲提取方便、迅速,超聲30min即可提取完全,故樣品的處理采用超聲提取30min。

以TLC法對(duì)制劑中的甘草、黨參及柴胡進(jìn)行定性鑒別,斑點(diǎn)清晰,專(zhuān)屬性好,無(wú)陰性干擾。芍藥苷為白芍中的主要成分,可用來(lái)作為中成藥中白芍的定量指標(biāo)成分。所建立的HPLC法測(cè)定芍藥苷含量簡(jiǎn)便、重復(fù)性好,可作為控制本品質(zhì)量的指標(biāo)。

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（實(shí)習(xí)編輯：陳廣海）

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